掉書袋 (五)

對魚類卵細胞發育而言，可區分為細胞發育(oocyte growth)與卵細胞最後成熟(final maturation)； 而細胞發育又可區分為初級 (primary)與次級(secondary)成長期，次級成長期分為前卵黃生成期(previtellogenic satge)與卵黃生成期(vitellogenic stage) (reviewed by Adachi et al.,2003) 我們對魚類卵黃生成期(vitellogenic stage) 與卵細胞最後成熟(final maturation)已經有相當程度的了解 (Nagahama, 1994; Senthilkumaran et al., 2004)；相反的，我們對於調控前卵黃生成期(previtellogenic)或初級卵黃生成期((primary vitellogenic)的卵細胞發育卻所知有限(Tyler and Sumpter, 1996)。基本上，性成熟鮭鳟魚類的孕卵數(fecundity)與卵子大小在卵細胞前卵黃(previtellogenic) 生成期時已經大部份決定 (reviewed by Kortner et al., 2009) 在魚類，控制前卵黃生成期的卵細胞之發育 其生理控制機制的研究並不多。在1986年在鯉魚中利用放射性促性腺激素(gonadotropin, GtH)證明 前卵黃生成期的卵細胞上並無促性腺激素受體(GtH receptor)的存在 (Bieniarz and Kime, 1986)；切除金魚腦下垂體(GtH主要來源)證明性類固醇可影響卵巢早期的發育 (Barannikova et al., 2002)；下海洄游生殖的歐洲鰻銀鰻 其卵巢已有初步發育 (GSI=1.5-2.0%) 卵細胞處於卵黃生成初期，但此時其循環系統內的促性腺激素濃度卻是几乎低於偵測敏感度 (Olivereau and Olivereau, 1979; Dufour et al., 1983) 這意味著和哺乳動物一樣卵細胞發育可分成兩期: 促性腺激素非依賴期(GtH-independent stage)與促性腺激素依賴期(GtH-dependent stage)，在脊椎動物生殖內分泌的研究中，長久以來卵巢發育一直被認為是被動地受到下視丘 (hypothalamus)─腦下垂體 (pituitary)─性腺 (gonad) H-P-G axis 由上而下的調控，性腺接受由腦下垂體分泌的 FSH 及 LH 而啟動卵巢發育。然而腦下垂體切除之大鼠，濾泡發育依然能夠由原始濾胞 (primordial follicle) 轉變成初級濾胞 (primary follcle)，顯然此過程是不需要 GtH 的作用 (Hirshfield, 1985)，反而是藉由許多卵巢內生因子(intraovarian factors)來調節 (reviewed by McGee and Hsueh, 2000)。哺乳動物前濾泡腔濾泡（preantral follicles）可類比於魚類前卵黃生(previtellogenic)成期的卵細胞；前濾泡腔濾泡在青春期前(prepubertal)緩慢的發育，被證實是GtH-independent 的，同時雄性素被證明和這個時期的濾泡發育有關 (McGee, 2000)，而且雄性素受體 (androgen receptor, AR) 基因的表現量被證明在前濾泡腔濾泡高於小型濾泡腔濾泡 (Weil et al., 1999)，在哺乳動物 雄性素刺激卵巢濾泡的增生與發育是被證明而被廣泛接受的 (reviewed by Sen and Hammes, 2010)；相反的，雌性素與助孕素對卵巢濾泡早期發育的作用不顯著 (reviewed by Choi and Rajkovie, 2006)。在魚類，雄性素也被證明具有刺激初級卵巢發育的效果，例如歐洲鰻(Anguilla Anguilla, Vedal et al., 2004) 日本鰻 (Anguilla japonica, Lin et al., 1996, 2000; Wang and Lou, 2007)澳洲鰻 (Anguilla australis, Rohr et al., 2001; Lokman et al., 2007) 鱈魚 (Kortner et al., 2008, 2009)。可見雄性素對初級卵巢發育在脊椎動物的演化上有其保守性，故若能了解雄性素對魚類初級卵巢發育生理機制，一方面可作為解決哺乳動物生殖問題的基礎 ，另一方面 控制孕卵數則可應用於漁業。


雄性素對初級卵巢發育的作用機制在哺乳動物中被證明除了直接經由濾泡細胞中的雄性素受體外 (Sen and Hammes, 2010)， 更多的證據顯示卵巢受雄性素刺激所產生的局部因子也伴演重要的角色， 這些因子包含成長因子， 如IGF-1 (Vendola et al., 1999)、轉譯因子如FOXO3a (Yang et al., 2010)等等，在哺乳動物中，許多卵巢所分泌的因子 (paracrine factors) 如PDGF (血小板衍生生長因子, platelet-derived growth factor;)、kit ligand (kit 配位體)、neurotrophins (神經營養素) leukemia inhibitory factor (白血病抑制因子) BMP (骨型態發生蛋白, bone morphogenetic proteins) FGF (纖維母細胞生長因子, Fibroblast Growth Factor) 等等都和初期卵巢發育有關 (reviewed by Webb et al., 2003; Campbell, 2009; Li et al., 2010) ，但至今仍無進一步實驗結果雄性素對卵巢的刺激發育作用在哺乳動物亦或在魚類是否也影響上列卵巢成長因子之表現。故本研究計畫擬研究雄性素對魚類初級卵巢發育的刺激作用和卵巢成長因子表現的關連。

本研究擬以鰻魚為研究模式生物其優點為 1). 鰻魚的生物特性，鰻魚若不下海進行生殖洄游，則其卵巢發育則停滯於初期初級卵細胞，若要在再發育成次級卵細胞則可利用腦下垂體研磨萃取液注射加以人工誘導，方便實驗之進行與控制；2). 一般認為日本鰻魚是一次產卵型的魚種，故卵細胞之發育有同步化的特性，方便實驗結果之研判；3). 鰻魚在台灣具相當的養殖歷史與養殖相關產業規模，但鰻苗完全依靠天然捕撈，具商業價值鰻魚人工繁殖方法仍未確立 (Tanaka et al., 2001)。

鰻魚人工繁殖的進行是利用腦下垂體研磨萃取液注射種鰻刺激性腺發育，目前實際所遇到的問題是: 1). 鰻魚種魚無客觀而有效的挑選標準； 2). 某些被挑選到的鰻魚種魚其孕卵數不高； 3) 並非所有的處理的鰻魚種魚都能達到最後成熟與排卵； 4). 腦下垂體研磨萃取液注射種鰻刺激性腺發育，易發生卵細胞發育不同步，影響誘導最後成熟時機的認定，導致受精率與孵化率低下。 就目前的實驗或試驗數據顯示：鰻魚人工繁殖的成功率(指得到較高的受精率與孵化率) 和種鰻本身的品質有關，銀化的程度影響卵巢對外源性腦下垂體研磨萃取液的感受性(Okamura et al., 2008)。

日本鰻的次級卵巢發育出現在黃鰻時期，時間可持續5-12年，以出現油滴為半判定標準，油滴的數目與大小隨著發育而增加；淡水養殖的雌鰻卵細胞只能發育至前卵黃蓄積期 (Pre-vitellogenic stage) (Chang and Liao, 1977; Yamanchi and Yamamoto, 1982)。當卵細胞發育至卵徑約 250μm以上的卵細胞會開始蓄積卵黃 (Kayaba et al., 2001) 而下海進行生殖洄游的銀鰻其卵細胞之大小約250-300μm。目前鰻魚人工繁殖，成熟卵是由注射異種生物 (主要是鮭魚與鯉魚) 腦下垂體研磨萃取液刺激其卵巢之發育而得；4週的腦下垂體研磨萃取液處理可使卵細胞發育至400-500 μm (mudvitellogenic stage)。另一方面，雖然使用腦下垂體研磨萃取液雖然能夠促進日本鰻卵濾胞的發育，但是長期催熟結果則是表現在卵胞數目減少、卵徑頻度分佈呈現不同步化 (Satoh et al., 1992; Tanaka et al., 2001; Wang and Lou, 2007)，影響最後的孕卵數 (fecundity)。研究試驗發現甲基睾固酮 (17α-methyltestosteone, MT) 併用腦下垂體研磨萃取液的處理組相較於雌二醇 (estradiol-17β, E2)併用腦下垂體研磨萃取液的處理組能顯著維持卵巢中較高濾胞的存活率，並且與僅有 腦下垂體研磨萃取液處理組的卵巢相比較，也使卵巢發育較能同步化 (Wang and Lou, 2007)。

鰻魚種魚其孕卵數不高的問題或許可從其他魚種找到解決問題的方法，如前卵黃生成期的卵細胞發育情形決定成熟鮭鳟魚類的孕卵數(fecundity)(reviewed by Kortner et al., 2009)，另一方面，雄性素被證明具有刺激鰻魚初級卵巢發育的效果 (歐洲鰻： Vidal et al., 2004； 日本鰻： Lin et al., 1996, 2000; Wang and Lou,2007；澳洲鰻, Rohr et al., 2001; Lokman et al., 2007)。在澳洲短鰭鰻與日本鰻的研究發現，雌鰻血漿中的睪固酮及 11-ketotestosterone (11-KT) 雄性素都高於同時期的雄鰻，同時也發現此兩種雄性素在前卵黃(previtellogenic)生成期到早期卵黃(early vitellogenic)生成期間有顯著增加的情形 (Sbaihi et al., 2001; Aroua et al., 2005; Han et al., 2003)。若如一般僅使用腦下垂體萃取物進行打針誘導，能藉由 H-P-G axis 進一步增加雄性素在雌鰻血漿中的濃度，在每針腦下垂體研磨萃取液 的誘導後 2 - 5 天會達高峰，之後又再下降，持續施打腦下垂體研磨萃取液能維持血漿中睪固酮的濃度，使卵巢能持續發育 (Leloup-Hatey et al., 1988; Peyon et al., 1997; Lokman et al., 2001; Matsubara et al., 2005)。另一方面，雖然使用腦下垂體研磨萃取液雖然能夠促進日本鰻卵濾胞的發育，但是長期催熟結果則是表現在卵胞數目減少、卵徑頻度分佈呈現不同步化 (Palstra et al., 2005)，腦下垂體研磨萃取液添加雄性素，一方面促進卵濾胞對腦下垂體研磨萃取液的感受性，使得卵濾胞進行卵黃蓄積並且同步化生長發育 (王, 2008 博士論文)，但相關活體證據解釋雄性素對卵巢發育早期作用的研究目前仍相當有限 (Walters et al., 2008)。

雄性素對初級卵巢發育的作用應該與血管新生(angiogenesis)有關，器官發育時需要血管新生進而建立其循環系統以支持其生長發育（Choi et al., 1998）。哺乳類動物卵巢濾泡(ovarian follicles)發育過程中會伴隨有周期性的血管新生，初期濾泡並無其本身建立的血管系統，靠的是卵巢本體組織的血液供應，濾泡發育過程中血管新生作用是持續的 (Suzuki et al., 1998)，濾泡血管網的建立與血管通透性的增加有助於生殖激素的傳入而抑制濾泡退化發生 (Zeleznik et al., 1981)。越多的血管生成會帶入更多的促性腺激素，而此輔助與加乘的結果會造成濾泡排卵。相反的，如果血管退化則引起濾泡退化 (Jiang et al., 2003)。血管供應的失效，是濾泡走向退化 (atresia) 的重要因素(reviewed by Kaczmarek et al., 2005)。

血管新生的過程包括靜脈微血管基底膜被酵素分解、血管內皮細胞的移行、增生和管狀形成（tube formation）（Klagsbrun and D’Amore, 1996），而在此過程中，舊有的微血管會受到鄰近新生組織所分泌之血管新生因子(angiogenic factors)的刺激與調控而萌發新的微血管網。血管內皮細胞生長因子 (vascular endothelial cells growth factor, VEGF）是刺激血管新生重要的因子（Ferrara and Henzel, 1989；Pepper et al., 1992; Klagsbrun and D’Amore, 1996）。血管內皮生長因子家族成員包含VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PIGF（placenta growth factor） （Tischer et al., 1991；Houck et al., 1991, 1992）。VEGF藉由跟酪胺酸激酶接受器(Tyrosine kinase receptor)的結合而引發血管活性，其中Flk (VEGFR2) 是主要出現在血管內皮細胞上的VEGF作用受體(Klagsbrun and D’Amore, 1996; reviewed by Shibuya, 2006)。最近的實驗結果顯示VEGF 分子在魚類 (斑馬魚、河豚、鰻魚、龍膽石斑) 與哺乳動物之間有相當強的保守性 (Huang et al., 2006；本實驗室尚未發表之成果)；但斑馬魚與河豚啟動子區域卻歧異，推測彼此的調控機制可能不同(Gong et al., 2004)。影響VEGF基因表現的因子分別是缺氧（hypoxia），細胞激素（cytokines）和生長因子（growth factors）的產生，細胞分化（differentiation）、細胞轉型（transformation）和性類固醇（sex steroids）等（Ferrara and Davis-Smyth, 1997; Ferrara, 1997, 2004; Reynolds et al., 2002），我們證明鰻魚的VEGF-A的表現機制也受類似因子的調控 (Huang et al., 2006)。

VEGF也是影響濾泡血管新生的重要的因子，VEGF的表現量與濾泡的發育程度具相關性 (Shimizu et al., 2002)。在大白鼠新生(neonatal)時期，其濾泡從primordial 發育到primary 濾泡，VEGF的表現是被刺激的 (Kezele et al., 2005)。在大鼠中，卵巢直接注射VEGF蛋白質會增加前腔化濾泡(pre-antral follicles)的數目 (Danforth et al., 2003)，相反地，利用抗VEGF抗體會降低濾泡血管新生，而減弱腔化濾泡(antrum follicles)的生長(Wulff et al., 2002)；同樣的，對小鼠施打抗Flk-1/KDR抗體(抗VEGF-2受體)會阻斷成熟濾泡的發育(Zimmermann et al., 2003)。濾泡的發育受促性腺激素(GTH)刺激，同時處理GTH與VEGF可以加強卵巢的發育：將VEGF基因片段混合孕馬胎盤絨毛膜促性腺激素(eCG)注射到卵巢，會增加較大濾泡的數目並且幫助鞘細胞層血管網的建立(Shimizu et al., 2003)。VEGF除和血管新生有關外，最近的實驗證明VEGF本身對卵巢濾泡細胞有直接的作用，例如可加強LH的功能 (Doyle et al., 2009)，也是濾泡細胞的生存因子 (survival role) (Irusta et al., 2010)，並刺激初級濾泡轉變成次級濾泡 (Yang and Fortune, 2007)，可抑制離體牛濾泡細胞之凋亡 (Kosaka et al., 2007)，但在魚類卻無相關研究報告。目前血管新生和大型魚類卵巢發育並沒有相關的研究報告。雖然在虹鱒中已證明卵巢的退化受E2、GTH、上皮成長因子(epidermal growth factor, EGF)的抑制 (Janz and Van Der Kraak, 2005)，而在哺乳動物中E2、GTH、EGF已證明可刺激濾泡細胞VEGF的表現(reviewed in Shimizu et al., 2002)，但沒有相關研究證明在魚類中，這些因子是否也是經由VEGF而抑制卵巢的退化。另一方面，在鰻魚人工催熟過程中卵細胞發育的不同步(asynchronous)，推測是因為外源激素處理所造成而非自然狀態 (Palstra et al., 2005)，但沒有相關證據了解是否因為血管新生不足而影響卵細胞發育的不平均(不同步)? 值得研究。事實上，我們的初步實驗結果發現：以CPE (catfish pituitary extracts) 處理雌鰻時，其卵巢GSI與對照組相比，有顯著的上升，顯示其卵巢的發育，但鰻魚GSI (卵巢發育) 與卵巢VEGF-Flk表現量之間呈負相關 (陳 2008; 張 2008)。

血管新生初期需要由VEGF所誘發，後期則需血管周邊細胞(pericytes)之遷徙並包覆新生血管管腔，達到穩定的成熟狀態。由VEGF所誘發的新生微血管並不成熟，無法完成封閉的閉鎖循環系統，需要其他因子來安定微血管的結構，這些因子包含血管新生素(Angiopoietin-1, Angpt1)，Angpt1為血管生成和血管新生的必須調控因子，它會與血管內皮細胞上的Tie2 受體結合以維持血管成熟，Angpt1不具有活化蛋白酶 (protease)以分解基底膜的特性，故使血管內皮細胞累積在局部而造成血管直徑增加 (Rudge et al., 2005)。Angpt1與其受體Tie2(為一種酪胺酸激脢受器，receptor tyrosine kinase)結合後，會引發一系列與血管內皮細胞與血管周邊細胞遷徙 (Fujikawa et al., 2002; Graupera et al., 2008)、細胞間交互作用、抗細胞凋亡(Papapetropoulos et al., 2000) 及抗通透性(Gavard et al., 2008)等相關之訊息傳遞路徑，故Angpt1亦可抑制VEGF對血管誘發之通透性，使血管內皮細胞間連結較緊密，在血管新生後期主要調控周邊細胞的遷移、細胞間連結。Angpt1、Tie2，與VEGF、Flk等相關血管生長因子在血管新生的功能相互協調制衡，以維持正常血管生成(Wakui et al., 2006)。同時我們也發現CPE處理之鰻魚其卵巢GSI與Angpt1的表現量呈負相關，可推測利用人工催熟造成的卵巢微血管系統的不穩定，亦或是其他原因有待新的實驗的證實。

雄性素 (T) 以經被證明，在鰻魚人工催熟過程中，幫助卵細胞發育的同步化與減少卵細胞的凋亡 (Wang and Lou, 2007)， T的單獨活體處理甚至可刺激鰻魚卵巢發育 (Anguilla japonica: Lin et al., 1991; Anguilla anguilla: Vidal et al., 2004)。事實上，我們的實驗結果發現：以CPE (catfish pituitary extracts)添加T處理雌鰻時，成功的救援鰻魚卵巢因處理CPE而抑制的VEGF-Flk表現量，CPE中T的添加其刺激卵巢發育比單用CPE所得的結果明顯，因此，此結果支持我們原先的假設，催熟鰻魚卵巢發育的不良的原因之一，是因為外源性激素處理抑制卵巢VEGF-Flk表現量，使得促性腺物質無法適當的發揮作用。

抗穆勒氏管荷爾蒙 (Anti-Mullerian hormone, AMH)又稱為穆勒氏管抑制物質(Mullerian inhibiting substance, MIS) 是屬於TGFb (transforming growth factor-bTGFβ superfamily) 家族 (Cate et al., 1986)， AMH 在哺乳類動物雄性發育過程中扮演重要的角色，主要為抑制雌性生殖組織穆勒氏管(mullerian duct)。近來AMH及其主要受器 (Anti-Mullerian hormone type II receptor, amhrII) 從不具該構造之硬骨魚類中選殖出來 (Wu et al., 2010)。但在雌性哺乳動物中，AMH 對濾泡發育扮演重要的角色，初級卵巢濾泡顆粒細胞製造AMH，前濾泡腔 (preantral)濾泡與濾泡腔(antral)濾泡其AMH表現量最高 (Kevenaar et al., 2006)；證據顯示 AMH可抑制FSH對卵巢中、小型濾泡的發育刺激作用，也會抑制原始(primordial)濾泡發育成初級濾泡 (reviewed by Visser et al., 2006)。AMH直接刺激離體(in vitro)大鼠前濾泡腔 (preantral)濾泡的發育 – 增加濾泡數量與大小 (McGee et al., 2001)。很有趣的是： AMH可刺激原始濾泡組織的VEGF的基因表現 (Nilsson et al., 2007)；相反的，若抑制VEGF的生物活性則可降低小猿卵巢前濾泡腔 (preantral)濾泡AMH的基因表現，但對早期濾泡腔(early antral)濾泡沒顯著影響 (Thomas et al., 2007)。

AMH可刺激原始濾泡組織的Angpt2 和VEGF的基因表現，卻抑制growth differentiation factor 9 (GDF-9)，的表現 (Nilsson et al., 2007)。GDF-9 也是屬TGFβ 家族中的一員，GDF-9會專一表現在卵細胞本體，由卵細胞本體製造AMH會促進周圍濾泡細胞的發育 (McGrath et al., 1995) ；剔除DGF-9的小鼠，其卵細胞發育會停滯在發育早期 (primary follicle stage)，其卵細胞僅具有單層的濾泡細胞(Dong et al., 1996)，故 GDF-9 會促進濾泡顆粒細胞的增生以及濾泡鞘細胞(theca cells) 的補充 (Vitt et al., 2000)，但會抑制由 FSH 所誘導的類固醇生成以及 LH 受體的表現 (Vitt et al., 2000b)；DGF-9也證明可促進小鼠前濾泡腔濾泡的成長，此作用是經由增加前濾泡腔濾泡雄性素的製造(Orisaka et al., 2009)。相較於哺乳類，GDF-9 在魚類的研究起步較晚，最早在斑馬魚的研究發現，GDF-9 在卵發育早期的基因表現量最高，隨著卵的成長發育會逐漸遞減 (Liu et al., 2007)。後續在澳洲短鰭鰻 (Anguilla australis: Lokman et al., 2009;) 及海鱸 (sea bass: Halm et al., 2008)的卵巢中也有 GDF-9 的表現。澳洲短鰭鰻的研究指出在早期卵黃生成期(early vitellogenesis)時 GDF-9的表現達到高峰，之後隨著卵黃蓄積進行開始下降 (Lokman et al., 2010)。故前濾泡腔濾泡(類比魚類前卵黃生成期的卵細胞)發育、DGF-9與雄性素三者有某種相關性。

前面提過VEGF可間接刺激濾泡血管新生或直街作用在濾泡細胞，事實上在哺乳動物中，許多卵巢所分泌的因子 (paracrine factors)，雖然到目前為止到底是那幾個因子扮演關鍵性的因子或是它們的組合的功能與效果，並不清楚，但是這些因子大都介由酪胺酸激酶接受器(Tyrosine kinase receptor)而引發作用，和VEGF結合血管內皮細胞上的Flk受體所引發的血管新生反應一樣，這些因子都有一個共同的起始訊息傳遞者PI3K (Phosphatidylinositol 3-kinase) 與PKB (protein kinase B)，因此PI3K的活化具有關鍵性的影響。目前已確定腫瘤抑制基因PTEN (phosphatase and tensin homology deleted from chromosome 10)的功能與PI3K相反。PTEN其表現的蛋白產物是一種多功能性的磷酸酶(phosphtase)，可抑制由PI3K所啟動的訊息傳遞路徑，許多研究結果顯示PTEN過度表現時，將抑制細胞的發育與增生。但另一方面 PTEN在正常細胞中可調控胚胎的發育，抑制PTEN基因的表現使老鼠胚體死亡 (Cully et al., 2004)；但降低PTEN的表現已證明促使細胞與組織增大(Crackower et al., 2002) 與提高細胞週期的作用 (reviewed by Di Cristofano and Pandolfi, 2000)。同時，由酪胺酸激酶接受器所引起的PI3K活化和其所引起的作用皆會被PTEN所抑制。故對於血管新生作用或濾泡早期發育而言，VEGF或卵巢的自泌因子 (paracrine factors) 具有啟動和促進的作用，而PTEN則扮演抑制的角色，這兩類因子的相互作用將可決定血管新生或對初期卵巢發育的效果。實驗證明小鼠卵細胞PTEN的剔除會導致卵細胞的過度早熟(Reddy et al., 2008; Jagarlamudi et al., 2009)； 而小鼠濾泡顆粒細胞PTEN的剔除則可以促進排卵並延長黃體壽命 (Fan et al., 2008)，更進一步的，小鼠幼鼠卵巢組織短期處理 PTEN抑制物 (bisperoxovanadium)與PI3K活化劑(740Y-P) 可活化小鼠的原始卵細胞(primordial oocytes)，類似的方法與操作可使人類的卵巢片段成功的發育至排卵前期 (Li et al., 2010)。對於性腺發育而言 促性腺激素(FSH, LH)是相當重要的，不管FSH 或 LH，其活性都是經由活化濾泡細胞細胞膜上的GPCR (G蛋白藕合的受體，G-protein coupled receptor)而引起的， 所引起的反應主要是經由 cAMP 或鈣離子的濃度改變而引起下游生化反應 (如PKA與PKC)。最近，利用細胞培養系統證明FSH可刺激小鼠施氏細胞(Sertoli cells) PTEN與PI3K的表現與活性，因此證明為何 FSH 無法刺激青春期前小鼠施氏細胞的增生，而反義PTEN cDNA的轉染可讓FSH 刺激小鼠施氏細胞的增生(Dupont et al., 2010)。我們證明： 鰻魚的PTEN具有長、短這兩個型式，此二者在細胞中的分怖並不一致，且短型PTEN的表現量和生理外觀具較密切的關連 (Chen et al., 2008; 陳 2009)：在鰻魚催熟過程中，卵巢發育(GSI)和長型PTEN表現呈負相關，卻和短型PTEN表現呈正相關；而添加T更進一步刺激卵巢發育(GSI)，卻抑制卵巢長型和短型PTEN的表現。所以理論上，短型PTEN和鰻魚卵巢發育有直接關係 (Huang et al., 2012)。鰻魚卵巢PTEN其功能與作用的釐清是本研究計畫的重點之一，利用第二訊息與PTEN的操作似乎可以在鰻魚上應用。

本實驗室先前的實驗結果證明，雖然目前無野生自然成熟鰻魚作為對照比較組，發現在卵巢人工催熟過程中，卵巢發育程度和血管新生基因表現密切相關 (陳 2009; 張 2009)，但在人工催熟過程中卵巢中VEGF-Flk系統的表現量是下降的。而睪固酮的添加，對鰻魚卵巢初期發育有改善的效果，我們初步的實驗證據顯示：此改善效果似乎是經由影響卵巢血管新生相關基因而達成，已經證明鰻魚GSI 可被T單獨刺激(Anguilla japonica: Lin et al., 1991; Anguilla anguilla: Vidal et al., 2004)，而我們也證明CPE添加T (CPE+T) 可刺激鰻魚卵巢VEGF-Flk表現。下一步，則要證明T (或其他類固醇) 和卵巢血管新生相關基因表現之間的影響。

越來越多的證據顯示 對卵巢初期發育而言 在這個階段經由其他因子刺激卵巢產生的卵巢自泌性因子對初期發育的啟動非常重要，這些自泌性因子中包含血管內皮生長因子 VEGF、Angpt1、insulin、IGFs、AMH、GDF-9和PTEN。本研究著重在外源性激素和鰻魚卵巢本身的自生性成長因子與抑制因子的交互作用。