掉書袋 (六)

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脊椎動物之生殖作用主要由下視丘-腦下垂體-性腺軸 (hypothalamic-pituitary-gonadal axis, HPG axis) 所調控，下視丘 (hypothalamus) 位於丘腦 (thalamus) 下方，除受體內生理狀況影響外，亦受周遭環境因子如光週期 (photoperiod)、溫度變化及社群狀態等因子刺激而由下視丘分泌促性腺激素釋放素 (gonadotropin-releasing hormone, GnRH)，經由體液系統運送至腦垂體前葉 (anterior pituitary gland) ，結合促性腺激素製造細胞 (gonadotrope) 上之受體而刺激濾泡刺激素 (follicle-stimulating hormone, FSH) 及黃體激素 (luteinizing hormone, LH) 等促性腺激素 (gonadotropins, GTHs) 的合成與分泌。來自腦下垂腺的促性腺激素是使性腺發育、產生配子與分泌性類固醇的第一信使(first messenger)，當促性腺激素與其受體結合，可活化腺苷酸環化酶 (adenylate cyclase, AC)，將三磷酸腺苷(ATP)代謝成所謂第二信使(secondary messenger)的環狀腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate, cAMP) (Sunahara and Taussig, 2002)。cAMP 隨後活化細胞內蛋白質激酶的訊息傳導路徑，進而增加類固醇生成相關的蛋白質與酵素基因的表現(e.g. Clark et al., 1995)。

 促性腺激素(FSH與LH與其類似物)的受體是屬於G蛋白偶聯受體（G Protein-Coupled Receptors， GPCRs）。GPCRs是一大類膜蛋白受體的統稱。這類受體的共同點是其立體結構中都有七個跨膜(7 transmembrane) α螺旋，且其肽鏈的C端和連接第5和第6個跨膜螺旋的胞內環上都有G蛋白（鳥苷酸結合蛋白）的結合位點 (Bockaert and Pin, 1999)。其引起的訊息傳遞路徑中，主要的兩個分別以刺激腺苷酸環化酶產生的cAMP和以C型磷脂酶(phospholipase C, PLC)生成的肌醇三磷酸(IP3)和甘油二酯(DAG)作為第二信使(secondary messenger)。第二信使活化蛋白質激酶(protein kinases)發揮作用，蛋白質激酶是催化蛋白質磷酸化的酶，根據其調節因子可分爲cAMP依賴性蛋白質激酶（PKA）、cGMP依賴性蛋白質激酶（PKG）和Ca2+依賴性蛋白質激酶（PKC）等。cAMP和cGMP分別變構活化PKA和PKG，IP3使Ca2+濃度升高，DAG提高PKC對Ca2+的敏感性。PKG的調節作用結果常與PKA系統的相反，組織中cAMP和cGMP的濃度變化也常互相消長 (Vezzosi and Bertherat, 2011)。

 cAMP和cGMP分別在各自的環狀核苷酸磷酸二酯酶(cyclic nucleotide phosphodieaterases, PDEs)催化下降解失活，因此PDE可以調控細胞內cAMP與cGMP的濃度，進而影響其訊息的傳遞或終結其所影響的生化作用。同時，PDE可改變cAMP或cGMP在細胞內的分佈，因為cAMP並不是均勻的在細胞內內分佈，反而是積累在細胞中的某些特定位置，若無PDE的存在，細胞將被活化後環化酶所產生的cAMP所淹沒，將無法維持特殊的時間與細胞空間內的cAMP濃度 (Zhang et al., 2002; Zaccolo, 2006; Vezzosi and Bertherat, 2011)。

 
人類細胞中，有多達21種PDE的基因被發現，目前PDE被分類成十一個家族，命名為PDE1至PDE11，這些不同家族的異構酶是依據不同的分子特性而區分，包含受質的專一性與親和性、酵素的調控分子差異、抑制劑的選擇性 (selectivity of inhibitors) 以及cDNA序列的相似性 (Theodore, 1998; Conti and Beavo, 2007; Houslay, et al, 2005)。PDE基因的轉譯可經由編碼剪接和/或使用多個起始子(promoter)而達成。在哺乳動物細胞中可能超過50種不同的PDE的蛋白質，故PDE有其命名系統: PDE家族由阿拉伯數字表示，後跟一個大寫字母表示家族中的基因，以及第二阿拉伯數字表示由單個基因衍生的變異（例如: PDE4D3，代表:家族4，基因D，變異3）(Mehats et al., 2002)。在十一個PDE家族中，PDE1、PDE3、PDE4、PDE7與PDE8對水解cAMP有專一性，而PDE5、PDE6與PDE9則對cGMP有高親和性，至於PDE1、PDE2、PDE10與PDE11則為cAMP及cGMP的水解酵素 (Conti and Beavo, 2007; Houslay, et al, 2005; Vezzosi and Bertherat, 2011)。

現在，已被證明六類的PDE可能在內分泌生理作用和內分泌疾病扮演特別的角色，分別是: PDE1, PDE2 (PDE2A), PDE3 (PDE3A), PDE4 (PDE4B and PDE4D), PDE8 (PDE8A and PDE8B), and PDE11 (PDE11A) (如下表; 源自Vezzosi and Bertherat, 2011)。

精巢高度表現PDE1A，1C，3B，5A，8A，10A，11A；並證明了在精巢中，PDE11A和精子生理有關而PDE8A調節類固醇激素的生產，但PDE11A對精子生成的作用還是無法確定；PDE8A有調控LH作用和睾丸萊氏細胞(Leydig cells)類固醇生成的功能，例如: PDE8A 基因缺陷的小鼠，其受LH所刺激的基礎睾固酮釋放量較對照組的高 (Vasta et al., 2006)。

卵巢有較高的PDE3A和PDE4D表現量，在人類卵細胞中PDE3是主要的PDE (Nogueira et al., 2003)，離體和活體實驗中證明PDE3A會促進卵細胞的成熟(Conti et al., 2002)。PDE4D對卵巢濾泡發育有重要的功能，離體實驗中在沒有促性腺激素的刺激下，PDE4D抑制劑會導致卵細胞的成熟（Tsafriri et al., 1996）； PDE4D基因缺陷的小鼠呈現排卵不正常和降低生育力，而生育力的降低證實是因為卵巢濾泡的功能和發育皆受損（Jin et al., 1999）。雖然PDE4D的失活不使濾泡的發育完全停滯，其卵細胞的存活率降低，導致後來排卵的數目的減少，也使促性腺激素刺激濾泡顆粒細胞(granusola cells)積累 cAMP ，雌激素的生產量和排卵率皆下降；濾泡顆粒細胞對促性腺激素的敏感性降低，也可由G蛋白偶聯受體（GPCRs）的層面來看。所以推測在PDE4D失活後，卵巢濾泡顆粒細胞的分化被干擾 (Vezzosi and Bertherat, 2011)。

 儘管FSH和LH兩者都可引發產生二級訊息cAMP，但其生物效應不只不同而且是相反的(Conti et al., 2002)。 FSH刺激雌激素的產生，並使濾泡顆粒細胞增生，而LH抑制雌激素的產生並抑制細胞週期的進行及使細胞完成分化。顆粒細胞中PDE4其活性可被FSH和LH所提高(Conti et al., 1984; Park et al., 2003)。後來的研究證明: FSH或LH分別可刺激PDE4B和PDE4D信使核糖酸核 (mRNA)的表現量(Park et al., 2003)。大鼠以PDE4抑制劑處理，可增加能其排卵的濾泡數目 (McKenna et al., 2005)。基於此結果，似乎PDE4抑制劑可用於加強促性腺激素對卵巢濾泡顆粒細胞的刺激作用。已證明PDE4抑制劑可取代LH與hCG的功能，刺激已前FSH處理過大鼠的排卵(McKenna et al., 2005)。

 

大多數的物種中，PDE4主要表現在濾泡顆粒細胞並不在卵細胞表現，在小鼠與其他物種中，PDE3主要表現在卵母細胞中 (Conti, 2011)， PDE3是卵細胞中主要的PDE (Richard et al., 2001; Conti, 2011)，PDE3A基因剔除造成雌性的不育，其所排的卵仍停滯在減數分裂前期，但這些卵有比野生型更高的 cAMP 含量，可驗證PDE3A活性的缺陷 (Masciarelli et al., 2004)。卵細胞要恢復減數分裂(卵細胞最後成熟)，降低其細胞中cAMP的含量是必要的，故活化卵細胞中PDE功能是LH誘導的卵成熟必要的步驟，可能的機制之一是PDE3A的活性受蛋白激酶B（PKB又稱Akt）的調節，實驗證明PKB可以磷酸化激活PDE3A和誘導蛙卵細胞的成熟(Andersen et al., 1998) 。

 

細胞內cAMP和cGMP含量對PDE的活性有迴饋控制，事實上，PDE的活性是由一連串的因子與作用所調節的，這些作用包括磷酸化、與小分子(cGMP的或磷脂酸)的交互作用、利用細胞內不同的分佈和與特定的蛋白質夥伴的接合。大多數PDE的調控部位均有磷酸化的部位，會受到蛋白激酶的磷酸化作用調控 (Theodore, 1998; Conti and Beavo, 2007)，PDE可被很多種類的激酶 (如: PKA，PKG，PKB和絲裂原活化的蛋白激酶(MAPK))所磷酸化 (Conti and Jin, 1999)。例如經由胰島素所刺激的脂肪分解，是由訊息串擾(crosstalk)所導致磷酸化PDE的例子；而FSH可經由PKB的途徑調節大鼠卵巢濾泡顆粒細胞中PDE4D的活性 (Wang et al., 2006)。但關於直接針對魚類性腺PDE的報告不多，利用cilostamide證明PDE3參與斑馬魚經由胰島素所刺激的卵細胞最後成熟 (Das et al., 2013)。

 

儘管哺乳動物的卵巢發育主要是由腦下垂體所分泌促性腺激素（FSH和LH）所控制，但卵巢存在複雜的局部因子彼此串導進而介導和/或影響促性腺激素的作用。哺乳動物卵細胞發育可分成兩期: 促性腺激素非依賴期(GtH-independent stage)與促性腺激素依賴期(GtH-dependent stage)，因為腦下垂體切除之大鼠，卵巢濾泡發育依然能夠由原始濾胞 (primordial follicle) 轉變成初級濾胞 (primary follicle)，顯然此過程是不需要 GtH 的作用 (Hirshfield, 1985)，反而是藉由許多卵巢內或旁分泌因子(intraovarian or paracine factors)來調節 (McGee and Hsueh, 2000；Webb et al., 2003)。在哺乳動物中，許多卵巢所分泌的因子如: 血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)、kit 配位體 (kit ligand )、神經營養素(neurotrophins)、 白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor)、骨型態發生蛋白( bone morphogenetic proteins, BMP )、纖維母細胞生長因子(Fibroblast Growth Factor, FGF ) 和血管內皮細胞成長因子(vascular endothelial cell growth factor, VEGF)等都和初期卵巢發育有關 (reviewed by Webb et al., 2003; Campbell, 2009; Li et al., 2010)。許多卵巢所分泌的因子(paracrine factors)和細胞激素，雖然到目前為止，並不清楚是那幾個因子是關鍵性的，與它們的組合的功能與效果，但是這些因子大都藉由酪胺酸激酶接受器(Tyrosine kinase receptor)所引發作用的，這些因子都有一個共同的起始訊息傳遞者PI3K (Phosphatidylinositol 3-kinase)與PKB (protein kinase B)，PKB (Akt) 所引發的信息路徑參與增殖、分化和凋亡等多種細胞功能的調節。而PDE的活性可被多種的激酶所磷酸化(PKA，PKG，PKB和MAPK) (Conti and Jin, 1999)，故卵巢內因子對促性腺激素非依賴期的卵巢發育，其中PDE的作用和功能值得研究。

 

魚類的生殖內分泌，也是由HPG軸線所控制(Donaldson, 1996; Yaron and Levavi-Sivan, 2006)。生殖機制的開啟是先由光週期、溫度、飼養、社群因素等條件所引發的刺激，經由神經系統接收這些外來訊息再傳遞至下視丘，下視丘則負責產生性釋素，刺激腦下垂體分泌促性腺激素，當中又可細分成GtH-I (FSH-like) 與GtH-II (LH-ike) 兩種，前者參與生殖荷爾蒙生成以及配子生成，後者則扮演協助成熟配子排出的任務（Donaldson, 1996; Arukwe, 2001；Yaron and Levavi-Sivan, 2006）。對魚類卵細胞發育而言，可區分為細胞發育(oocyte growth)與卵細胞最後成熟(final maturation)； 而細胞發育又可區分為初級 (primary)與次級(secondary)成長期，次級成長期分為前卵黃生成期(previtellogenic satge)與卵黃生成期(vitellogenic stage) (reviewed by Adachi et al.,2003) 我們對魚類卵黃生成期(vitellogenic stage) 與卵細胞最後成熟(final maturation)已經有相當程度的了解 (Nagahama and Yamashita, 2008; Senthilkumaran et al., 2004)；相反的，我們對於調控前卵黃生成期或初級卵黃生成期的卵細胞發育卻所知有限(Tyler and Sumpter, 1996)。在魚類，控制前卵黃生成期的卵細胞之發育 其生理控制機制的研究並不多。利用放射性促性腺激素證明鯉魚前卵黃生成期的卵細胞上並無促性腺激素受體的存在 (Bieniarz and Kime, 1986)；下海洄游的歐洲鰻(Anguilla anguilla)其卵巢已有初步發育 (GSI=1.5-2.0%) 卵細胞處於卵黃生成初期，但其促性腺激素濃度卻是低於偵測敏感度 (Olivereau and Olivereau, 1979; Dufour et al., 1983)，這意味著和哺乳動物一樣，魚類卵巢發育可藉由許多卵巢內生因子(intraovarian factors)來調節 (reviewed by Ge, 2005)。

 

切除金魚腦下垂體(GtH主要來源)證明性類固醇可影響卵巢早期的發育 (Barannikova et al., 2002)。哺乳動物前濾泡腔濾泡（preantral follicles）可類比於魚類前卵黃生成期的卵濾泡，前濾泡腔濾泡在青春期前(prepubertal)緩慢的發育，被證實是促性腺激素非依賴的，同時雄性素(androgens)被證明和這個時期的濾泡發育有關 (McGee and Hsueh, 2000)，而且雄性素受體 (androgen receptor, AR) 基因的表現量被證明在前濾泡腔濾泡高於小型濾泡腔濾泡 (Weil et al., 1999)，在哺乳動物雄性素具刺激卵巢濾泡的增生與發育的功能(reviewed by Sen and Hammes, 2010)。在魚類，雄性素也被證明具有刺激初級卵巢發育的效果，例如歐洲鰻(Vidal et al., 2004)、日本鰻 (Lin et al., 1991; Wang and Lou, 2007; Huang et al., 2012)、澳洲鰻 (Rohr et al., 2001; Lokman et al., 2007) 和鱈魚 (Kortner et al., 2008, 2009)，可見雄性素對初級卵巢發育在脊椎動物的演化上有其保守性。實驗證據也顯示卵巢受雄性素刺激所產生的局部因子也扮演重要的角色，這些因子包含成長因子如IGF-1 (Vendola et al., 1999)、轉譯因子如FOXO3a (Yang et al., 2010)等。在哺乳動物中，許多卵巢所分泌的因子 (paracrine factors)都和初期卵巢發育有關 (reviewed by Webb et al., 2003; Campbell, 2009; Li et al., 2010) ，但至今仍無進一步實驗結果雄性素對卵巢的刺激發育作用在哺乳動物亦或在魚類是否也影響上列卵巢成長因子之表現。雄性素被證明具有刺激鰻魚初級卵巢發育的效果 (歐洲鰻： Vidal et al., 2004； 日本鰻： Lin et al., 1991; Wang and Lou, 2007；澳洲鰻, Rohr et al., 2001; Lokman et al., 2007)。

哺乳類動物卵巢濾泡(ovarian follicles)發育過程中會伴隨有周期性的血管新生(angiogenesis)，濾泡發育過程中血管新生作用是持續的 (Suzuki et al., 1998)，濾泡血管網的建立與血管通透性的增加有助於生殖激素的作用(Zeleznik et al., 1981)；相反的，血管的退化是引起濾泡退化 (atresia) 的重要因素((Jiang et al., 2003； Kaczmarek et al., 2005)。血管內皮細胞生長因子 (vascular endothelial cells growth factor, VEGF）是刺激血管新生重要的因子（Ferrara and Henzel, 1989；Pepper et al., 1992; Klagsbrun and D’Amore, 1996），Flk (VEGFR2) 是VEGF主要的作用受體(Klagsbrun and D’Amore, 1996; reviewed by Shibuya, 2006)。VEGF 分子在魚類 (斑馬魚、河豚、鰻魚、龍膽石斑) 與哺乳動物之間有相當強的保守性 (Huang et al., 2006；本實驗室尚未發表之成果)。影響VEGF基因表現的因子分別是缺氧（hypoxia），細胞激素（cytokines）和生長因子（growth factors）的產生，細胞分化（differentiation）、細胞轉型（transformation）和性類固醇（sex steroids）等（Ferrara and Davis-Smyth, 1997; Ferrara, 2001, 2004; Reynolds et al., 2002），我們證明鰻魚的VEGF-A的表現機制也受類似因子的調控 (Huang et al., 2006)。

在哺乳動物，卵巢VEGF的表現量與濾泡的發育程度具相關性 (Shimizu et al., 2002)。VEGF本身對卵巢濾泡細胞有直接的作用，例如可加強LH的功能 (Doyle et al., 2010)，也是濾泡細胞的生存因子 (survival factor) (Irusta et al., 2010)，並刺激初級濾泡轉變成次級濾泡 (Yang and Fortune, 2007)，可抑制離體牛濾泡細胞之凋亡 (Kosaka et al., 2007)，但在魚類卻無相關研究報告。目前血管新生和大型魚類卵巢發育並沒有相關的研究報告，雖然在虹鱒中已證明卵巢的退化受E2、GTH、上皮成長因子(epidermal growth factor, EGF)的抑制 (Janz and Van Der Kraak, 2005)，而在哺乳動物中E2、GTH、EGF已證明可刺激濾泡細胞VEGF的表現(Shimizu et al., 2002)，但沒有相關研究證明在魚類中，這些因子是否也是經由VEGF而抑制卵巢的退化。

血管新生初期需要由VEGF所誘發，後期則需血管周邊細胞(pericytes)之遷徙並包覆新生血管管腔，新生微血管無法形成閉的鎖循環，需要其他因子來安定微血管的結構，這些因子包含血管新生素(Angiopoietin-1, Angpt1)，Angpt1可抑制VEGF對血管誘發之通透性，使血管內皮細胞間連結較緊密，在血管新生後期主要調控週邊細胞的遷移、細胞間連結 (Wakui et al., 2006)，Angpt1為血管生成和血管新生的必須調控因子。 鰻魚的Angpt1 已經被選殖出來，證明也具使微血管成熟的功能(Huang et al., 2010)。Angpt1不具有活化蛋白酶 (protease)的特性，故使血管內皮細胞累積在局部而造成血管直徑增加 (Rudge et al., 2005)。Angpt1與其受體Tie2結合後，會引發一系列與血管內皮細胞與血管周邊細胞遷徙 (Fujikawa et al., 2002; Graupera et al., 2008)及抗通透性(Gavard et al., 2008)等相關之訊息傳遞路徑， Angpt1、Tie2，與VEGF、Flk等相關血管生長因子在血管新生的功能相互協調制衡，以維持正常血管生成(Wakui et al., 2006)。

前面提過VEGF可間接刺激濾泡血管新生或直接作用在濾泡細胞，事實上在哺乳動物中，許多卵巢所分泌的因子 (paracrine factors)，雖然到目前為止到底是那幾個因子扮演關鍵性的因子或是它們的組合的功能與效果，並不清楚，但是這些因子大都藉由酪胺酸激酶接受器(Tyrosine kinase receptor)而引發作用，如VEGF-Flk和 Angpt1-Tie2引發的血管新生反應一樣，這些因子都有共同的起始訊息傳遞者PI3K (Phosphatidylinositol 3-kinase) 與PKB (protein kinase B)，因此PI3K的活化具有關鍵性的影響。已確定腫瘤抑制基因類脂磷酸酶PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)和PI3K相反。其中PTEN其表現的蛋白產物是一種多功能性的磷酸酶(phosphtase)，可抑制由PI3K所啟動的訊息傳遞路徑，由酪胺酸激酶接受器所引起的PI3K活化和其所引起的作用皆會被PTEN所抑制(Hamada et al., 2005)。研究結果顯示PTEN過度表現時，將抑制細胞的發育與增生。但另一方面 PTEN在正常細胞中可調控胚胎的發育，抑制PTEN基因的表現使老鼠胚體死亡 (Cully et al., 2004)；但降低PTEN的表現已證明促使細胞與組織增大(Crackower et al., 2002) 與提高細胞週期的作用 (reviewed by Di Cristofano and Pandolfi, 2000)。對於血管新生作用或濾泡早期發育而言，VEGF或卵巢的旁泌因子 (paracrine factors) 具有啟動和促進的作用，而PTEN則扮演抑制的角色，這兩類因子的相互作用將可影響初期卵巢發育的效果。實驗證明小鼠卵細胞PTEN的剔除會導致卵細胞的過度早熟(Reddy et al., 2008; Jagarlamudi et al., 2009)； 而小鼠濾泡顆粒細胞PTEN的剔除則可以促進排卵並延長黃體壽命 (Fan et al., 2008)，更進一步的，小鼠幼鼠卵巢組織短期處理 PTEN抑制物 (bisperoxovanadium)與PI3K活化劑(740Y-P) 可活化小鼠的原始卵細胞(primordial oocytes)，類似的方法與操作可使人類的卵巢片段成功的發育至排卵前期 (Li et al., 2010)。對於性腺發育而言 促性腺激素(FSH, LH)是相當重要的，不管FSH 或 LH，其活性都是經由活化濾泡細胞細胞膜上的GPCR而引起的， 所引起的反應主要是經由 cAMP 或鈣離子的濃度改變而引起下游生化反應 (如PKA與PKC)。最近，利用細胞培養系統證明FSH可同時刺激小鼠精巢施氏細胞(Sertoli cells) PTEN與PI3K的表現與活性，因此推論為何 FSH 無法刺激青春期前(prepubertal)小鼠精巢施氏細胞的增生，而反義PTEN cDNA的轉染可讓FSH 刺激小鼠施氏細胞的增生(Dupont et al., 2010)。

 

本研究計畫擬以鰻魚所具有的生物特性為研究模式生物的選擇因為: 1、鰻魚若不下海進行生殖洄游，則其卵巢發育則停滯於初期初級卵細胞，若要再次發育成次級卵細胞則可利用腦下垂體研磨萃取液注射加以人工誘導，方便實驗之進行與控制；2、一般認為日本鰻魚是一次產卵型的魚種，故卵細胞之發育有同步化的特性，方便實驗結果之研判；3、鰻魚在台灣具相當的養殖歷史與養殖相關產業規模。另一方面，鰻魚在台灣具相當的養殖歷史與養殖相關產業規模，但鰻苗完全依靠天然捕撈，具商業價值鰻魚人工繁殖方法仍未確立 (Tanaka et al., 2001)，故鰻魚生殖生理的研究有實際的產業應用價值。鰻魚人工繁殖的進行是利用腦下垂體研磨萃取液注射種鰻刺激性腺發育，目前實際所遇到的問題是: 1、鰻魚種魚無客觀而有效的挑選標準； 2、某些被挑選到的鰻魚種魚其孕卵數不高； 3、並非所有的處理的鰻魚種魚都能達到最後成熟與排卵； 4、腦下垂體研磨萃取液注射種鰻刺激性腺發育，易發生卵細胞發育不同步(asynchronous)，影響誘導最後成熟時機的認定，導致受精率與孵化率低下。

雖然使用腦下垂體研磨萃取液雖然能夠促進日本鰻卵濾胞的發育，但是長期催熟結果則是表現在卵胞數目減少、卵徑頻度分佈呈現不同步化 (Satoh et al., 1992; Tanaka et al., 2001; Palstra et al., 2005；Wang ang and Lou, 2007)。研究試驗發現甲基睾固酮 (17α-methyltestosteone, MT) 併用腦下垂體研磨萃取液的處理組相較於雌二醇 (estradiol-17β, E2)併用腦下垂體研磨萃取液的處理組能顯著維持卵巢中較高濾胞的存活率，並且與僅有腦下垂體研磨萃取液處理組的卵巢相比較，也使卵巢發育較能同步化 (Wang and Lou, 2007； Huang et al., 2012)。腦下垂體研磨萃取液添加雄性素，可能促進卵濾胞對腦下垂體研磨萃取液的反應敏感性，使得卵濾胞生長發育同步化(王, 2008 )，但相關活體證據解釋雄性素對卵巢發育早期作用的與研究目前仍相當有限 (Walters et al., 2008)，

VEGF的表現量與哺乳動物濾泡的發育具相關性 (Shimizu et al., 2002)。在鰻魚人工催熟過程中卵細胞發育的不同步，推測是因為外源激素處理所造成而非自然狀態 (Palstra et al., 2005)，但沒有相關證據了解是否因為血管新生不足而影響卵細胞發育的不平均(不同步)? 事實上，本實驗室先前的實驗結果證明，雖然目前無野生自然成熟鰻魚作為對照比較組，發現在鰻魚卵巢人工催熟過程中，卵巢發育程度影響血管新生基因的表現(陳 2009; 張 2009)，以鯰魚腦下垂體研磨萃取液 (catfish pituitary extracts, CPE) 處理雌鰻時，其卵巢發育程度與對照組相比，有顯著的提升，但鰻魚卵巢發育與卵巢VEGF-Flk表現量之間呈負相關 (陳 2008; 張 2008)。同時我們也發現CPE處理之鰻魚其卵巢發育與Angpt1的表現量呈負相關，可推測利用人工催熟造成的卵巢微血管系統的不穩定，若以CPE添加T處理雌鰻時，則成功的救援鰻魚卵巢因處理CPE而抑制的VEGF-Flk表現量，而且CPE中T的添加其刺激卵巢發育比單用CPE所得的結果明顯(陳 2009; 張 2009)，因此，此結果支持我們原先的假設，催熟鰻魚卵巢發育的不良的原因之一，是因為外源性激素處理抑制卵巢VEGF-Flk與干擾Angpt1表現量，使得促性腺物質因循環不良的關係無法適當的發揮作用。而睪固酮的添加，對鰻魚卵巢初期發育有改善的效果，我們初步的實驗證據顯示：此改善效果似乎是經由影響卵巢血管新生相關基因而達成，而我們也證明CPE添加T (CPE+T) 可刺激鰻魚卵巢VEGF-Flk表現。下一步，則要證明T (或其他類固醇) 和卵巢血管新生相關基因表現之間的影響。

我們實驗室證明: 添加雄性素可刺激卵巢血管新生相關因子的基因表現(Chang et al., 2009； 陳 2009; 張 2009)並抑制卵巢PTEN基因與蛋白質的表現 (Huang et al., 2012)。鰻魚的PTEN具有長、短這兩個型式，此二者在細胞中的分佈並不一致，且短型PTEN的表現量和生理外觀(phenotypes)具較密切的關連 (Chen et al., 2008; 陳 2009；Huang et al., 2012)：在鰻魚催熟過程中，卵巢發育和長型PTEN表現呈負相關，卻和短型PTEN表現呈正相關，而添加T更進一步刺激卵巢發育(GSI)，卻抑制卵巢長型和短型PTEN的表現。所以理論上，短型PTEN和鰻魚卵巢發育有直接關係 (Huang et al., 2012)。另一個問題，並非所有的處理的鰻魚都能達到最後成熟，顯示個體卵巢對腦下垂體研磨萃取液的反應敏感度不一，顯示鰻魚種魚無客觀而有效的挑選標準。PTEN抑制劑與PDE4抑制劑的應用試驗似乎可用於加強腦下垂體研磨萃取液對卵巢發育的刺激作用。

儘管卵巢發育主要是由腦下垂體所分泌促性腺激素（FSH和LH）所控制，但卵巢存在複雜的局部因子(如VEGF、FGF、Angpt1、insulin、IGFs…)彼此串導進而介導和/或影響促性腺激素的作用，而促性腺激素的作用經G蛋白偶聯受體引起受PDE所調節，這些局部成長因子的作用若由酪胺酸激酶接受器所引發，則會被PTEN所抑制。本研究計畫聚焦在在雄性激素和鰻魚卵巢本身的自生性成長因子與抑制因子對卵巢發育的交互作用。目的是由卵巢生理著手期能改善鰻魚的人工催熟效果，幫助產業的永續發展。

 

參考文獻:

-          張宸瑋 (2008) 高雄大學 生物技術研究所 碩士論文.

-          陳雅玫 (2008) 高雄大學 生物技術研究所 碩士論文.

-          王永松( 2008) 台灣大學 漁業科學研究所 博士論文.

-          Adachi, S., Ijiri, S., Kazeto, Y. and Yamauchi, K. (2003) Eel biology, Blackwell Publishing Asia, pp. 301–317.

-          Andersen, C.B., Roth, R.A. and Conti, M. (1998) J Biol Chem., 273:18705-18708.

-          Arukwe, A. (2001) Mar pollu Bull., 42( 8): 643–655.

-          Barannikova, I.A., Dyubin, V.P., Bayunova, L.V. and Semenkova, T.B. (2002) Neurosci Behav Physiol., 32(2):141-148.

-          Bieniarz, K. and Kime, D.E. (1986) Gen Comp Endocrinol., 64(1):151-156.

-          Campbell, B.K. (2009) Anim. Reprod., 6(1):159-171.

-          Cate, R.L., Mattaliano, R.J., Hession, C., Tizard, R., Farbe,r N.M., Cheung, A., Ninfa, E.G., Frey, A.Z., Gash, D.J. and Chow, E.P. (1986) Cell, 45 (5): 685–698.

-          Chang, C-W., Chen, Y-M., Lee, Y-H. and Huang, Y-S. (2009) The16th International Congress of Comparative Endocrinology (ICCE2009), Hong Kong, Jun. 22-26, 2009. p117.

-          Chen,Y.-F., Jeng,S.-R., Chen,M.-C., Gwo,J.-C. and Huang, Y.-S. (2008). The Open Zoology Journal, 1: 1-10.

-          Clark, B.J., Soo, S.C., Caron, I.M., Ikeda, Y., Parker, J.L. and Stocco, O.M. (1995) Mol Endocrlnol., 9: 1346-1355 .

-          Conti, M. (2011) Curr Opin Pharmacol., 11(6):665-669.

-          Conti, M., Kasson, B.G., Hsueh, A.J. (1984) Endocrinology, 114:2361-2368.

-          Conti, M. and Jin, S.L. (1999) Nucleic Acids Res. Mol. Biol., 63:1–38.

-          Conti, M. Andersen, C.B., Richard, F., Mehats, C., Chun, S.Y., Horner, K., Jin, C. and Tsafriri, A. (2002) Mol Cell Endocrinol., 187:153–159.

-          Conti, M. and Beavo, J. (2007) Annu Rev Biochem., 76: 481 – 511.

-          Crackower,M.A., Oudit,G.Y., Kozieradzki,I., Sarao,R., Sun,H., Sasaki,T., Hirsch,E., Suzuki,A., Shioi,T., Irie-Sasaki,J., Sah,R., Cheng,H-Y.M., Rybin,V.O., Lembo,G., Fratta,L., Oliveira-dos-Santos, A.J., Benovic, J.L., Kahn,C.R., Izumo,S., Steinberg,S.F., Wymann,M.P., Backx,P.H. and Penninger, J.M. (2002) Cell, 110:737-749.

-          Cully,M., Elia, A., Ong, S-H., Stambolic, V., Pawson, T., Tsao, M-S. and Mak, T.W. (2004) Procd Natl Academ Sci USA., 101(43):15358-15363.

-          Das D, Khan P.P. and Maitra, S. (2013) Mol Cell Endocrinol., 374(1-2):46-55.

-          Di Cristofano A, Pandolfi PP. (2000) Cell, 100:387-90.

-          Doyle, L.K.,Walker, C.A. and Donadeu, F.X. (2010) Domest Anim Endocrinol., 38(3):127-137.

-          Donaldson, E. M. (1996) Anim Reprod Sci., (1996) 42( 1–4):381–392

-          Dufour, S., Delerue-Le Belle, N. and  Fontainea, Y.-A. (1983) Gen Comp Endocrinol., 52(2):190–197.

-          Dupont,J.,M usnier,A., Decourtye,J., Boulo,T., Lecureuil,C., Guillou,H., Valet,S., Fouchecourt,S., Pitetti,J.-L., Nef,S., Reiter,E. and Crepieux, P. (2010) Mol Cell Endocrinol., 315: 271-276.

-          Fan, H.-Y., Liu, Z., Cahill, N. and Richards, J.S. (2008) Mol Endocrinol., 22: 2128-2140.

-          Ferrara, N. (2001) Am J Physiol Cell Physiol., 280, C1358-C1366.

-          Ferrara, N. (2004) Endo Rev., 25, 581-611.

-          Ferrara, N. and Henzel, W. J. (1989) Biochem Biophy Res Commu., 161:851-858.

-          Ferrara, N. and Davis-Smyth, T. (1997)  Endo. Rev.,, 18, 4-25

-          Fujikawa, K., Christensen, R.A., Madore, R., Oettgen, P. and Varticovski, L. (2002) J Cell Biochem., 85:505–515.

-          Ge, W. (2005) Mol Cell Endocrinol., 237(1-2):1-10.

-          Garcıa-Lopez, A., Sanchez-Amaya, M, Tyler, C. R. and Prat, F. (2001) Reproduction, 142: 243–253

-          Graupera, M., Guillermet-Guibert, J., Foukas, L.C., Phng, L.K., Cain, R.J., Salpekar, A., Pearce, W., Meek, S., Millan, J., Cutillas, P. R., Smith A.J.H., Ridley, A. J., Ruhrberg, C., Gerhardt, H. and Vanhaesebroeck, B. (2008) Nature, 453: 662-666.

-          Gavard, J., Patel,V. and Gutlind, J.S. (2008) Develp Cell., 14: 25-36.

-          Halm, S., Rocha, A., Miura, T., Prat, F. and  Zanuy, S. (2007) Gene, 388(1-2):148-158.

-          Halm, S., Ibañez, A.J., Tyler, C. R. and F. Prat, F. (2008) Mol Cell Endocrinol., 291(1–2): 95–103.

-          Hamada, K., Sasaki, T., Koni, P.A., Natsui, M., Kishimoto, H., Sasaki, J., Yajima, N., Horie, Y., Hasegawa, G., Naito, M., Miyazaki, J.I., Suda, T., Nakao, K., Mak, T.W., Nakano, T. and Suzuki, A. (2005) Gene Develop., 19:2054–2065.

-          Hirshfield, A. N. (1985) Biol Reprod., 32 (4):979-987.

-          Houslay, M. D. et al. (2005) Drug Discovery Today, 10:1503 – 1519.

-          Huang, Y-S., Huang, W-L., Lin, W-F., Chen, M-C. and Jeng, S-R. (2006) Comp Biochem Physiol., 145A:33-46

-          Huang, Y.S., Chang, C.W., Chen, Y.M., Lee, Y.H., Chen, M.C. and Shih, N.L. (2010) Comp Biochem Physiol., Part A,155:350–360.

-          Huang, Y. S., Chen, Y. M., Liao, P.C., Lee, Y. H., Gwo, J. C., Ming-Chyuan Chen, M. C. and Chang, C. F. (2012) Fish Physiol Biochem., 38:777-787.

-          Irusta, G., Abramovich, D., Parborell, F., Tesone, M. (2010) Mol Cell Endocrinol., 325: 93-100.

-          Janz, D.M. and Van der Kraak,G. (2005) Gen. Comp. Endocrinol., 105:186-193.

-          Jagarlamudi,K., Liu,L., Adhikari,D., Reddy,P., Idahl,A., Ottander,U., Lundi,E. and Liu,K. (2009) PLoS. 4(7): e6186.

-          Jiang, J.Y., Macchiarelli, G., Tsang, B. K. and Sato, E. (2003) Reproduction. 125: 211-223.

-          Jin, S.L., Richard, F.J., Kuo, W.P., D’Ercole, A.J. and Conti, C. (1999) Procd Natl Academ Sci USA., 96: 11998–12003.

-          Kaczmarek,M.M., Schams,D. and Ziecik,A.J. (2005) Reprod. Biol., 5:111-136.

-          Kevenaar, M.E., Meerasahib, M.F., Krame,r P., van de Lang-Born, B.M., de Jong, F.H., Groome, N.P., Themmen, A.P. and Visser, J.A. ( 2006) Endocrinology, 147:3228–3234.

-          Klagsbrun, M, and D'Amore, P.A. (1996). Cytokine Growth Factor Rev., 7: 259-270.

-          Kortner, T.M., Rocha, E., Silvab, P., Castroc, L.F.C., Augustine Arukwe, A. (2008) Comp Biochem Physiol.,  Part D, 3( 3):205-218.

-          Kortner, T. M., Rocha, E. and Arukwe, A. (2009) Comp Biochem Physiol., Part A, 152(3):304-313.

-          Kosaka,N.; Sudo,N.; Miyamoto,A.; Shimizu,T. (2007) Biochem.Biophy.Res.Commu. 363:133-137.

-          Li, J., Kawamura, K., Cheng, Y., Liu, S., Klein, C., Liu, S., Duan, E.-K., Hsueh, A.J.W. (2010) Procd  Natl  Academ Sci USA,. 107(22):10280-10284.

-          Lin, H-R., Zhang, M-L., Zhang, S-M., Van Der Kraak, G. and Peter, R.E. (1991) Aquaculture, 96: 87-95.

-          Liu, L. and  Ge, W. (2007) Biol Reprod., 76 (2):294-302.

-          Lokman, P.M., George, A, N. K., Divers, S. L., Algie, M. and Young, G. (2007) Reproduction, 133: 955-967.

-          Lokman, P.M., Kazeto, Y., Ozaki, Y., Ijiri1, S., Tosaka1, R., Kohara, M., Divers, S. L., Matsubara, H., Moore, L. G. and Adachi, S. (2010) Reproduction, 139:71-83.

-          Luckenbach, J.A., Iliev, D.B., Goetz, F.W. and  Swanson, P. (2008) Reprod Biol  Endocrinol., 6:2. doi:10.1186/1477-7827-6-2

-          Masciarelli, S., Horner, K., Liu C, Park SH, Hinckley M, Hockman S, Nedachi T, Jin C, Conti M, Manganiello V (2004) J Clin Invest., 114:196-205.

-          Mehats, C., Andersen, C.B., Filopanti, M., Jin, S.L. and Conti, M. (2002) Trends Endocrinol Metab., 13(1):29-35.

-          McGee, E.A. and Hsueh, A.J. (2000) Endocr Rev., 21(2):200-214.

-          McKenna, S.D., Pietropaolo, M., Tos, E.G., Clark, A., Fischer, D., Kagan, D., Bao, B., Chedrese, P.J. and Palmer, S. (2005) Endocrinology, 146:208-214.

-          Miura, T., Miura, C., Konda, Y. and Yamauchi, K. (2002) Development, 129: 2689-2697.

-          Nagahama, Y. and Yamashita, M. (2008) 50(Suppl 1):S195–S219.

-          Nilsson, E., Rogers, N. and Skinner, M.K. (2007) Reproduction, 134: 209-221.

-  Olivereau, M. and Olivereau, J. (1979) Gen Comp Endocrinol., 39: 247-261.

-  Orisaka, M., Tajima, K., Tsang, B.K. and Kotsuji, F. (2009) J Ovarian Res.,2:9 doi:10.1186/1757-2215-2-9

-          Palstra, A.P., Cohen, E.G.H., Niemantsverdriet, P.R.W., van Ginneken, V.J.T., van den Thillart, G.E.E.J.M. (2005) Aquaculture. 249:533-547.

-          Park, J.Y., Richard, F., Chun, S.Y., Park, J.H., Law, E., Horner ,K., Jin, S.L. and Bockaert, J. and Pin, J. P. (1999) EMBO J., 18(7) :1723–1729.

-          Pepper, M. S., Ferrara, N., Orci, L. and Montesano, R.（1992）Biochem. Biophys. Res. Commun. 189, 824-831.

-          Reddy,P., Liu,L., Adhikari,D., Jagarlamudi,K., Rajareddy,S., Shen,Y., Du,C., Tang,W., Hamalainen,T., Peng,S.L., Lan,Z-J., Cooney,A.J., Huhtaniemi, I. and Liu, K. (2008) Science, 319: 611-613.

-          Reynolds, L. P., Grazul-Bilska, A. T. and Redmer, D. A.（2002）Int J Exp Pathol., 83: 151-163.

-          Richard, F.J., Tsafriri, A. and Conti, M. (2001) Biol Reprod., 65:1444-1451.

-          Rohr , D. H., Lokman, P. M., Daviea, P. S. and Young, G. (2001) Comp Biochem Physiol Part A 130:701 -714.

-          Rudge, J., Thurston, G., Wang, Q., Baffert, F., Papadopoulos, N., Jean-Guillaume, D., Wiegand, S., Yancopoulos, G.D. and McDonald, D.M. (2005) Development, 132:3317-3326

-          Satoh, H., Nimura, Y. and Hibiya, T. (1992) Nippon Suisan Gakk., 58: 1211-1218.

-          Sen, A. and Hammes, S,R. (2010) Mol Endocrinol., 24(7):1393-1403.

-          Senthilkumarana, B., Yoshikunia, M. and Nagahama, Y. (2004) Mol Cell Endocrinol., 215(1–2):11–18.

-          Shimizu,T., Jiang,J.-Y., Sasada,H. and Sato,E. (2002) Biol. Reprod. 67, 1846-1852.

-          Shibuya,M (2006) J Biochem Mol Biol., 39(5):469-478.

-   Sunahara, R.I. and Taussig, R. (2002) Mol Interv.,  2: 168 -184.

-  Suzuki, T., Sasano, H., Takaya, R., Fukaya, T., Yajima, A. and Nagura, H. (1998) Hum      Reprod. 13(4):953-959.

-  Tanaka, H., Kagawa, H., and Ohta, H. (2001) Aquaculture, 201:51-60.

-          Theodore, J. T. (1998) Am J Resp Crit Care Med., 157:351 – 370

-          Tsafriri, A., Chun, S.Y., Zhang, R., Hsueh, A.J. and Conti, M. (1996) Develop Biol., 178:393–402.

-          Tyler, C. R. and Sumpter, J. P. (1996) Rev Fish Biol Fish., 6(3): 287-318.

-          Vasta, V., Shimizu-Albergine, M.  nd  Beavo, J.A. (2006) Procd Natl Academ Sci USA., 103:19925–19930.

-          Vendola, K., Zhou, J., Wang,J. and Bondy, C.A. (1999) Hum Reprod., 14(9):2328-2332.

-          Vezzosi, D. and Bertherat, J. (2011) Euro J Endocrinol., 165:177–188.

-          Vidal, B., Pasqualini,C., Le Belle,N., Holland,M.C.H., Sbaihi,M., Vernier,P., Zohar,Y. and Dufour, S. (2004) Biol Reprod., 74: 1491-1500.

-          Visser, J.A., de Jong, F.H., Laven, J. S. E. and Themmen, A.P.N. (2006) Reproduction, 131: 1-9.

-          Wakui,S., Yokoo,K., Muto,T., Suzuki,Y., Takahashi,H., Furusato,M., Hano,H., Endou,H. And Kanai,Y. (2006) Lab Invest., 86: 1172-1184.

-          Walters, K.A., Allan, C.M. and Handelsman, D.J. (2008) Biol Reprod., 78(3):380-389.

-          Wang, Y.S. and Lou, S.W. (2007) J.Fish.Soci.Taiwan, 34: 261-273.

-          Wang, Z,. Pan, L., Luo, J., Wang, H. and Shi, F. (2006) Reprod Nutr Dev., 46(2):179-87.

-          Webb, R., Nichola,s B., Gong, J.G., Campbell, B.K., Gutierrez, C.G., Garverick, H.A. and Armstrong, D.G. (2003) Reprod., (Suppl.) 61:71-90.

-          Weil, S., Vendola, K., Zhou, J. and Bondy, C.A. (1999) J Clin Endocrinol Metab., 84(8):2951-2956.

-          Yang, M.Y. and Fortune, J. E. (2007) Mol. Reprod. Develop,. 74: 1095-1104.

-          Yang, J.L., Zhang, C.P., Li, L., Huang, L., J,i S.Y., Lu, C.L., Fan, C.H., Cai, H., Ren, Y., Hu, Z.Y., Gao, F. and  Liu, Y.X. (2010) Endocrinology, 151(2):774-782.

-          Yaron, Z. and Levavi-Sivan, B. (2006) The Physiology of Fishes, 3rd edn., pp.343–386.

-          Zaccolo, M. (2006) Euro J Cell Biol., 85:693–697.

-          Zhang, H.T., Huang, Y., Jin, S.L., Frith, S.A., Suvarna, N., Conti, M. and O’Donnell, J.M. (2002) Neuropsychopharmacol., 27:587–595.

-          Zeleznik, A.J., Schuler, H.M. and Reichert, L.E. Jr. (1981) Endocrinology, 109(2):356-362.