「薪火相傳-稀少科研技術永續傳承計畫」
以應用為導向的日本鰻（Anguilla japonica）生殖生理研究
1. 技術之稀少性及其如何具體展現其在所屬領域的重要性。
從生命科學視角來看，鰻魚 (Anguilla spp.) 的生態與生活史，鰻魚經歷兩次變態與淡水和深海兩種環境中轉換，還仍有許多未解的謎團。這也導致沒有足夠的背景知識來複製鰻魚生殖的條件和幼苗生存環境。日本鰻（Anguilla japonica）屬於降海產卵的洄游魚類，具高經濟價值，也是完全依賴捕撈野生苗的魚種。東亞鰻苗漁獲總量年平均約45公噸，近數十年來野生捕撈鰻苗數量呈現減少趨勢，在今（2024）年漁季（2023年12月～2024年4月左右）僅捕獲33公噸，不僅年減3成，還創下五年來新低。有關鰻苗捕獲量減少的原因，ㄧ般認為和淡水棲地惡化與減少、環境污染、全球環境變遷、海洋洋流狀況和鰻苗過漁有關。世界自然保護聯盟（IUCN）已於2014年六月12日將日本鰻認定為瀕危物種 （https://zh.cn.nikkei.com/politicsaeconomy/politicsasociety/9682-20140613.html）。
從民生經濟方面來看，鰻魚曾是台灣最重要的養殖魚種，養成的鰻魚主要外銷到日本，1980年代，臺灣是日本鰻魚市場最大的供應者（佔80%），對平衡台日貿易逆差有所幫助。但2023年日本進口加工鰻與活鰻幾乎全來自大陸（分別是：47841公噸與21424公噸）而來自台灣的加工鰻與活鰻分別僅有423公噸和5167公噸，而且以批發價格來看，顯示中國產品質已超越台灣的。在2024年漁季，鰻苗捕獲量創下五年來新低，導致鰻苗價格高漲，造成養鰻成本大幅提高。
多年來，鰻魚的人工繁殖始終無法突破，直到2010年才由日本水產綜合研究中心成功人工完全養殖。人工繁殖鰻苗死亡率很高，因為缺乏背景知識來複製鰻魚生殖的條件和幼苗生存、生活環境。2016年日本鰻苗的人工繁殖成本約為4萬日元/尾，2024年七月日本水產廳的水產資源研究所(橫浜)發表大量生產日本鰻魚苗的技術，預期將降低到1,800日圓/尾。日本研究團隊從遺傳的角度篩選出快速成長的魚苗，並利用雞蛋和脫脂奶粉等常見原料開發初期飼料、穩定生產和提高效率，日本的目標是將鰻苗的人工繁育成本降至1,000日圓元/尾以下。日本水產廳繁殖推進部表示：「通往商業化的道路已經形成」。（https://cn.nikkei.com/industry/agriculture/56063-2024-07-05-10-44-23.html）。
日本的成功既具競爭力也有助於鰻魚天然資源的復育。台灣也有和日本類似的經驗，但在官方正式的報告中尚無鰻苗人工繁殖成功的紀錄，遑論商業化，雖然日本幾乎已經卻立相關技術，但在台灣的經驗鰻魚人工繁殖所遇到的問題包含：種鰻的培育與確認、催熟方法的確立、幼苗餌料與幼苗飼育環境的確立; 年復一年，几己乎每次的人工催熟操作都是獨立事件，無法歸納取得確定的評斷標準和統一操作模式，以致目前仍採取以量取勝的策略。由於鰻苗支出占總生產成本一半以上，優先取得鰻魚人工繁殖技術並達到量產，將可取得商業競爭優勢；一旦日本將該繁殖技術申請智財權成功，將會對台日中三地鰻魚產業造成重大轉變 （https://www.ctee.com.tw/news/20240718700114-439901）。在中國，鰻魚的人工繁育技術攻關也曾列到“七五”“八五”“九五”等五年計劃中。但由於鰻魚人工繁殖有其難度，難以突破，中國鰻魚育種進程一度停滯，2001年後，鰻魚人工繁殖再也沒有列入中國國家級的重大科技計劃中 （國鰻：如何從零到世界第一？）。但中國相當關注2024年日本水產廳發表大量生產日本鰻魚苗技術的消息，並邀集相關學者專家共同研商，初步結論還是：鰻魚人工繁殖技術的成熟度和產業化應用，距離能滿足養殖所需、實現商業化鰻苗生產還有很長的路要走。但在2024年4月底，中國在上海召開“國家水産育種聯合攻關計劃—鰻鱺繁育聯合攻關研討會”。鰻魚人工繁殖被擺到了重要位置。“要把批量培養人工繁殖柳葉鰻作為主攻方向，持續優化鰻鱺的人工繁殖技術，獲得高質量合子，加強仔魚培育研究，力爭突破柳葉鰻培育技術並最終培育出玻璃鰻” （國鰻：如何從零到世界第一？ http://big5.news.cn/gate/big5/www.xinhuanet.com/fortune/20240627/4a22d9222ac04f0183b6b09eb27ef49b/c.html）。
而台灣方面則還沒有看到有任何具體的回應和行動。
在台灣，鰻魚人工繁殖試驗的相關工作主要由農業部水產試驗所執行，但隨著漁業政策的更迭，與研究人員的退休，水產試驗所已經停止編列相關的經費。在學界，專門研究鰻魚的實驗室幾乎屈指可數（海洋大學、台灣大學、高雄大學、高雄科技大學），研究鰻魚的老師不到五人，很難與台灣鰻魚產業的經濟歸規模相稱，也不容易得到相關部門的經費支持，鰻魚研究，特別是生殖生理的研究，在這一批老師退休後就斷層了，因若計畫要直接躍進鰻魚人工繁殖，依日本與中國的經驗，非得要傾國家級計畫、時間以五年為單位，還不一定能成功，何況台灣資源有限，實驗室整合不易。同時，在申請計畫時往往被其他更強勢（容易被大眾看到、容易有成果、容易和他國接軌，或是政策的需要）的計畫所排擠。若研究生殖生理又有其他的實驗動物（斑馬魚、海水鯛魚、烏魚、石斑魚…）可選擇，因為在人為環境（養殖池）中牠們更容易完成生命週期與操作，還有另外的原因是這些物種有品系可循，但鰻魚是隨機交配 (panmixia) 物種，依我們實驗室的研究結果（Huang et al., 2021），鰻魚的基因背景差異明顯，故非得增加研究樣本的個數才能得到較一致的趨勢，這一點在人類也有類似的結論 （The 1000 Genomes Project Consortium, 2012)。若這倆物種遇到類似的問題，都有明顯的基因表現個體差異，那解決此問題的方法應該也是可以相互支援的。
或許鰻魚的研究對台灣並不重要，或許日本考慮相關的成本與飼養環境，日本會在台灣成立鰻魚人工繁殖中心或成立相關商業機構，或許評審委員也會提出：「日本都已經確認技術與生產流程，台灣就不用再發花資源去補助這個毫無前景的計畫」，這些看法與建議都沒錯。但站在台灣研究自主性和生命科學教育的角度，研究鰻魚有台灣特殊的長處，包含科學與文化經濟，若台灣只是注重所謂「生命科學中的大科學」，那生命科學研究與教育就缺少對本土物種與本土生態的關注。若「生命科學中的大科學」是解決全人類的問題，那對本土物種與本土生態的關注是解決我們自身的問題，而且兩者是互通的，特殊的物種可容易的解答某些生物學的共同問題。
2. 計畫推動願景與技術傳承具體做法。
本計畫推動的願景包含人文面和科學面。
人文面：
1. 使參與人員（大學部與研究生）了解農（漁）業產業的特性與必要。
2. 介紹鰻魚養殖與產業在台灣發展的歷史，藉由產業參訪與現地踏查，讓參與人員了解，鰻魚養殖的地理特性。
3. 鰻魚養殖相關產業（鰻苗捕撈和鰻魚養殖）對台灣漁村經濟發展的貢獻與影響。
4. 從鰻苗撈捕、鰻苗馴養、養鰻現場、養鰻管理、鰻魚收穫、鰻魚出口、鰻魚加工、鰻魚料理等等入手，讓參與人員了解鰻魚在生物和環境、文化的關聯中所存在的角色，而不是只是一種食物，而且還是很貴不一定要吃的食物。
5. 鰻魚養殖與產業在現今經濟與自然環境變動下如何轉型與其實例。
科學面：
基本上鰻魚的生活史本身就是一個生物學有待釐清的問題，因為鰻魚的生活史還存在很多謎團，鰻魚經歷兩次變態與淡水和深海兩種環境中轉換。基於此，鰻魚人工繁殖的建立不是一個‘短期而速成’的過程，不是短期的KPI考核。我們實驗室一直專注於建立鰻魚種魚的認定與人工催熟技術的優化，從早期的型態觀察至利用卵巢轉錄體為方法，在學理基礎上試圖在傳統催熟方法中加入輔助因子，以增加催熟的效率與效果。
人工飼養之鰻魚或野生鰻魚尚無在人為環境下自然性成熟之紀錄。而目前鰻魚人工受精卵之取得，皆由長期注射異種生物激素而達到。異源性腦下垂體萃取液注射， 以卵巢濾泡細胞的發育情形或產卵效果，銀鰻 （silver eel）的反應比黃鰻 (yellow eel) 的好，顯示鰻魚的成長階段與激素處理的效果有相關性。銀化 (silvering)，為鰻魚的第二次變態， 也是鰻魚青春期啟動 (onset of puberty) 的必要步驟。銀化可能是為了適應海洋生殖洄游做準備，因此也可將鰻魚的銀化視為準備青春期的開始 (preparation for the beginning of puberty)。但銀化如何被調控，仍所知有限。如果鰻魚被拘限在淡水環境中，銀鰻青春期啟動 (the onset of puberty) 卻是被抑制，雖然可達巨大體型。青春期的發動與個體的年齡及成長的體型有關，因爲體型和活體堆積的能量有正相關; 而且鰻魚下海或人工催熟過程中，鰻魚是不攝食的，這期間至少要三個月至半年。所以鰻魚是研究成長、能量堆積和生殖啟動的好物種，此外在長時間的禁食下，所堆積的能量如何轉換，其控制的生理機制與參與的激素系統都是很有趣很神奇，應該也可應用到生物醫學。基本上，在淡水環境中不下海，鰻魚的生殖內分泌活性是被抑制，但是其卵巢還是可有限度的發育 (GSI ≤ 3.0 %)。銀鰻和黃鰻的區別是外觀型態的，但在養殖環境中此外觀型態的差別是模糊的，唯有卵巢卵濾泡的發育才是絕對的標準，發育已達初級卵巢以上的鰻魚才會對腦下垂體萃取液有反應，而雄性素可使鰻魚卵巢發育至初級卵巢。但對刺激鰻魚初級卵巢發育而言，雄性素注射處理的效果，銀鰻的也比黃鰻的顯著，而且雄性素對銀鰻卵巢的刺激效果還是有明顯個體差異。這些觀察讓我們多年來提出一連串的研究計畫，包含：能量代謝激素和卵巢發育的關係; FGF21、PPARs、insulin對鰻魚卵巢人工催熟發育所扮演的可能角色; 雄性素對添加對鰻魚人工催熟卵巢發育的影響; PTEN對雄性素刺激鰻魚卵巢發育過程中所扮演的角色; 添加PDE3, PDE4 抑制劑對於鰻魚人工催熟的影響; 卵巢基因背景對雄性素刺激鰻魚卵巢發育效果的關聯。可惜決大部分未獲通過，唯二兩次通過補助（PTEN對雄性素刺激鰻魚卵巢發育過程中所扮演的角色，卵巢基因背景對雄性素刺激鰻魚卵巢發育效果的關聯），分別發表科學論文數篇並被邀稿發表專書專章。
其間也發展出ㄧ些可應用的技術，如：緩釋配方（避免每週打擾鰻魚）、非醫學專業內視鏡判斷鰻魚性別、發展鰻魚外科手術可同時取樣肝臟與卵巢組織（此技術可克服因個體差異所造成需大量樣本才能得到判斷處理效果）; 硬體方面：發展循環水低溫鰻魚催熟循環系統。
我們已證明雄性素可刺激鰻魚初級卵巢發育，但其效果仍有個體差異，我們的初步結果顯示（已發表科學期刊報告），鰻魚卵濾泡若大於100m 則對雄性素刺激有反應，反之則處理無任何效果。即使卵濾泡均大部分大於100m，其對雄性素的敏感性還是有差異，其處理前基因背景（處理前卵巢轉錄組）和其對雄性素的敏感性有關，但基因背景中某些基因表現量的高低並無法預測對雄性素的敏感性，因為我們可追蹤同一隻個體處理前後的卵巢轉錄組，基因的表現倍率 (FC) 直接反應雄性素的效果，但每隻魚基因背景並不一致並呈現「缺失 – 存在變異 (absence – presence variations)」。這現象代表基因組所存在的變異，這現象在其他脊椎動物中並未被發表過。
最重要，以上的成果要感謝中央研究院資訊研究所的協助，他們利用鰻魚基因體骨架（genome scaffolds）協助轉錄體的拼接與序列校準，因為鰻魚並非模式生物，非模式生物的轉錄體一般皆利用「從頭定序（de novo sequencing）」，「從頭定序」指沒有參考序列（reference sequence）來組裝定序結果，此結果會拼裝出巨量但不存在該物種中的基因序列，導致分析的困難與結果的失真。例如同一基因其mRNA異構物 (isoforms) 的出現，特別是經過三次全基因組複製（3rd WGD）的魚類，mRNA異構物 (isoforms) 的數量與其功能，值得研究。從此基礎衍生出的：非轉譯長RNA (LncRNA, long non-coding RNA) 也是生物基因調控研究的研究熱區。
本次計畫擬繼續研究：
採取比較同一個體激素處理前後的轉錄組，累積數據，利用大數據分析從多次結果中找出規律，也希望能建立所謂的「生物標記 (biomarkers)」，作為建立篩選種鰻的標準。
1. 確認鰻魚人工催熟過程中，對激素處理敏感者生殖系統發育和其他系統（能量代謝系統、血液血球系統、感覺系統、消化道箘相）的相關性。
2. 研究如何改變催熟環境條件與相關添加物，改進催熟卵巢發育的效果。
3. 學生/研究人員參與及培育規劃。
1. 建立學生對於水產養殖的概念，從養殖了解農業的重要與農業科學研究的重要性。
2. 讓學生了解漁業生物和水生生物研究的特殊性，與野生動物和馴化動物研究的差異。
3. 了解鰻魚特殊的生活史，知道鰻魚的兩次變態、銀化的過程控制和下海洄游的特性。
4. 與鰻魚為何成為瀕危須受保護的生物，瀕危須受保護的生物還有哪些。
5. 了解如何用生物特性研究生物學的問題。熟練生物實驗室的實驗設計與實驗操作。
6. 了解生物外表型和基因型的相關，並研究基因如何形成外表型。
7. 了解轉錄組分析與生物大數據概念，如何應用於農業研究。
8. 了解基因組和轉錄組的差異與關係，轉錄組如何產生與其組成（mRNA, ncRNA），其意義與生物功能。
4. 其他支持與落實稀少/稀有技術持續留存之規劃。
有些生命科學研究的停滯或缺席帶來的不僅是研究層次的落後，更嚴重的還有人才的斷層，我們無法回到當初公務部門與學界對研究鰻魚的力度和態度，或許當初有點不一樣，現在的結果也不一樣。基礎研究需要資源的支持，産學研的合作模式中，只有在研究單位和企業發展均能雙贏才有成案和延續的可能。但對於鰻魚研究來講，很難馬上給企業帶來收益，企業不願投入財力，研究資源只能依靠公務部門的支持。台灣第一代研究與從事鰻魚生物學的學者、技術人員已經退休，現有的研究人力大多得不到穩定資源的協助，沒有這一代的傳帶，很多實驗、試驗所需的技術與資料，等想到時，都要從頭再來。
所以，只有在公務部門協助，專項經費支持，建立研究團隊，積累大量的基礎研究資料，可建立本土的生物學基礎，也可為鰻魚人工繁殖技術突破的基礎。希望形成鰻魚種魚培育與認定，甚至資源保存，鰻種魚催熟、催産和孵化仔魚，和鰻苗培育的技術。當研究單位的成果對私人企業發展有實質幫助時，能馬上給企業帶來收益，企業才有利潤投入支持研究的長期存在，甚至成為企業文化與擔負社會責任。
主要參考文獻：
- Yung-Sen Huang*, Ya-Mei Chen, Pei-Chi Liao, Yan-Horn Lee, Jin-Chywan Gwo, Ming-Chyuan Chen, Ching-Fong Chang (2012) Testosterone improves the transition of primary oocytes in artificial maturation eels (Anguilla japonica) by altering ovarian PTEN expression. Fish Physiology and Biochemistry. 38:777-787.
- Mei-Hwa Lee , James L. Thomas, Zi-Lin Su, Zheng-Xiang Zhang, Chu-Yun Lin, Yung-Sen Huang**, Chien-Hsin Yang***, Hung-Yin Lin, (2020) Doping of transition metal dichalcogenides in molecularly imprinted conductive polymers for the ultrasensitive determination of 17β-estradiol in eel serum. Biosensors and Bioelectronics. 150:111901. https://doi.org/10.1016/j.bios.2019.111901.
- Yung-Sen Huang*, Xuan-Hao Wu, Pei-Syuan Huang, Guan-Ru Chen (2020) Correlation between the ovarian status and the androgen sensibility in the cultured Japanese eel, Anguilla japonica. Fish Physiology and Biochemistry. 46:1063–1074. https://doi.org/10.1007/s10695-020-00772-1.
- Yung-Sen Huang*, Wen-Chih Cheng & Chung-Yen Lin (2021) Androgenic sensitivities and ovarian gene expression profiles prior to treatment in Japanese eel (Anguilla japonica). Mar Biotechnol., 23:430–444. https://doi.org/10.1007/s10126-021-10035-6.
- Yung-Sen Huang* and Chung-Yen Lin (2021). Stimulatory Effects of Androgens on Eel Primary Ovarian Development - from Phenotypes to Genotypes [Online First], IntechOpen, DOI: 10.5772/intechopen.99582. Available from: https://www.intechopen.com/online-first/78202
- Yung‑Sen Huang* · Chung‑Yen Lin · Wen‑Chih Cheng (2021) Investigating the Transcriptomic and Expression Presence‑Absence Variation Exist in Japanese Eel (Anguilla japonica), a Primitive Teleost. Mar Biotechnol., 23(6):943-954. doi: 10.1007/s10126-021-10077-w.
專書專章
- Jin-Chywan Gwo, Chang, Ching-Fong and Yung-Sen Huang* (2013) “ PTEN function on angiogenesis, ovarian development, and body growth from Anguilla japonica a primitive vertebrate”, in "PTEN: Structure, Mechanisms-of-Action, Role in Cell Signaling and Regulation" , Ke Xu ed., Chapter 10, page235-249. ISBN: 978-1-62808-049-0. Nova Science Publishers, Inc. New York, USA.
- Yung-Sen Huang* and Chung-Yen Lin (2022). “Stimulatory Effects of Androgens on Eel Primary Ovarian Development - from Phenotypes to Genotype”, in “Animal Reproduction”, Bozkurt ed., Chapter 7, IntechOpen Limited, London, UK. ISBN 978-1-83969-515-5. (https://www.intechopen.com/chapters/78202)
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