掉書袋 (七) “重複注射是否過度刺激卵巢亦或是抑制卵巢的抗氧化脢 ?

就目前盛行的魚類人工繁殖，操作上可能只須注射腦下垂體研磨萃取液一至二針來達成，因其已經到達性熟(卵巢發育完全)，所欠缺的是引發堆積在腦下垂體中促性腺刺激素(GTH) 的高峰釋放 (discharge)，進而引發配子的最後成熟 (final maturation) 與排卵 (ovulation) 及排精 (spermation)。鰻魚人工繁殖首先要刺激其卵巢之發育，讓卵徑由 250-300μm發育至700-800μm，這是藉由長期注射異種生物(鮭、鯉、鯰等)腦下垂體研磨萃取液 (內含促性腺激素，gonadotropin, GTH與其他腦下垂體激素) 而達成。注射腦下垂體研磨萃取液，讓配子從初級或次級生殖細胞發育到成熟與排精、卵，需要施打數十針，時間也必須拉長至2-3個月。4-5週的腦下垂體研磨萃取液處理可使卵細胞發育至400-500 μm (vitellogenic stage)。另一方面，雖然使用腦下垂體研磨萃取液雖然能夠促進日本鰻卵濾胞的發育，但是長期催熟結果則是表現在卵胞數目減少、卵徑頻度分佈呈現不同步化 (Satoh et al., 1992; Tanaka et al., 2001; Wang and Lou, 2007)，並影響最後的孕卵數 (fecundity)。

長期注射異種生物腦下垂體研磨萃取液刺激鰻魚卵巢之發育，此種操作手法類似於哺乳動物的”人工輔助生殖技術 (assisted reproductive technology, ART)”，ART 的操作是: 對哺乳動物重複注射高劑量的促性腺激素已獲得足夠數量的成熟卵子 (Xie et al., 2016)，就人類臨床而言，一般接受ART的婦女大都要接受數回的外來促性激素注射以刺激卵巢的發育，到最後為求人工生殖成功的確保，往往以激素誘發超級排卵 (superovulation)，以收集較多的卵子。在人類醫學與畜牧業，利用注射外源性促性腺激素以誘發超級排卵 (superovulation) 是一種成熟的技術，此技術可增加有優良基因品種的胚胎供應，在技術發展的早期，胚胎的存活率卻是有很大的變異，而且胚胎發育遲緩或不正常是常見的 (reviewed by Betteridge, 1977)，實驗證明注射外源性促性腺激素是導致受精或胚胎發育失敗的重要原因之一 (Walton et al., 1983)。ART的結果顯示: 濾泡液中某些”氧化壓力指標 (oxidative stress index)”的高低和生育是否成功有關，這些氧化壓力指標 (活性氧簇 (ROS)、脂肪過氧化 (lipid peroxides, LPO) 、一氧化氮(NO)、丙二醛(MAD)) 若越高則生育成功率則越低 (Das et al., 2006)。在大鼠中證明適度的氧化壓力(OS)刺激卵巢中激素鞘-間皮細胞 (theca-interstitial cells) 的增生，而較高的氧化壓力則有抑制的效果 (Duleba et al., 2004)。

活性氧簇 (reactive oxygen species, ROS)，例如過氧化氫（H 2 O 2）和超氧化物 (Superoxides)，是細胞正常的訊息傳遞者和代謝的產物 (Fang et al., 2002)，也包含製造ATP的氧化磷酸化 (Cao et al., 2007)。卵巢基本上是個新陳代謝旺盛的器官，呼吸作用中由於氧氣的不完全還原導致超氧化物陰離子（O2·）的產生，ROS在生物中是必要的，但在ROS和抗氧化劑 (antioxidants) 之間的不平衡，即造成”氧化壓力 (oxidative stress, OS)”。氧化壓力(OS)的出現是因為細胞內活性氧簇 (ROS) 的製造超過抗氧化清除 (antioxidant scavenging) 的能力。超氧化物自由基(superoxide radicals) 和一氧化氮(NO)是細胞主要合成的ROS，這些ROS在生物中由不同部位的NADPH氧化酶 (NADPH oxidase) 和一氧化氮合酶(NO synthase)所產生 (reviewed by Sugino, 2005)，這些酶在生殖系統的大部分組織中是高度表現與有高活性的，這暗示ROS對生殖的重要性 (reviewed by Poljsak et al., 2011)。免疫細胞 (白血球) 是卵巢活性氧簇 (ROS) 的重要來源 (reviewed by Sugino, 2005)，而濾泡細胞則是ROS另一個主要來源，在卵濾泡發育過程中，超氧自由基 (superoxide  radicals)，因著細胞代謝和類固醇合成，會在細胞質和線粒體產生ROS，包含超氧自由基 (superoxide radicals)，ROS可抑制類固醇合成 (Sugino, 2005)。在濾泡生成(folliculogenesis) 過程中，自由基 (free radicals ) 與抗氧化劑 (antioxidants) 一起扮演複雜而多功能的角色 (reviewed by Diamanti-Kandarakis et al., 2017) 。

從另一方面來講，大多數的細胞會因激素或因子的刺激(stimuli)而產生低量的ROS，這些激素或因子包含: 細胞激素（TGF-1，TNF-和IL）、胜肽生長因子（PDGF、 EGF、VEGF、bFGF和胰島素）和 G蛋白偶聯受體(G protein– coupled receptors, GPCR)的配體（ligands）或GPCR受體之活化劑 (agonists） (reviewed by Rhee et al., 2003)。用GPCR活化劑使細胞內的ROS濃度在刺激時瞬時增加，ROS的產生主要由NADPH-氧化酶 (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase) 的家族所催化與控制 (reviewed by Cattaneo, et al., 2014)，免疫細胞吞噬性的NADPH氧化酶也可被GPCR配體所活化，且氧化酶的活性可被各種激酶和銜接蛋白所調節，GPCR和細胞激素受體也偶聯到不同的NADPH氧化酶異構物(Figure 1)( Rhee et al., 2003)。

NADPH氧化酶 (NADPH oxidase) 可被GPCR所活化而增加細胞內ROS的產生，但GPCR如何活化NADPH氧化酶的機制並不清楚 (Petry et al., 2010)。

許多生長因子活化受體酪氨酸激酶（Receptor Tyrosine Kinase, RTK）（如VEGF，PDGF和bFGF，以及胰島素和血管生成素）也可增加細胞內ROS的產生 ( Schiller, 2006)。已知血小板衍生生長因子（Platelet-derived growth factor，PDGF）可經由其細胞表面受體誘發產生過氧化氫 (Bae et al., 1997 )，進一步的研究證明，在非免疫細胞中，此作用是經由磷脂醯肌醇-3激酶 (Phosphatidylinositol-3-Kinase, PI3K) 所引發的，而PI3K所主導的細胞訊息傳遞鍊中，其下游Rac1扮演連接PI3K和NADPH氧化酶產生過氧化氫的角色 (Bae et al., 2000)。過氧化氫經由氧化蛋白質序列上的半胱氨酸殘基 (cysteine residues) 而控制磷酸激酶、轉錄因子和離子通道等的活性(reviewed by Rhee et al., 2003)。磷酸酶 (phosphatase) 控制RTK的活性，而ROS抑制磷酸酶的作用而間接控制了RTK活化與非活化狀態的平衡 (reviewed by Cattaneo, et al., 2014)。同時，因成長因子所誘發產生的過氧化氫會抑制酪胺酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase)的活性，例如PTEN (Tension homology deleted on chromosome ten, PTEN)  (Leslie et al., 2003)，PTEN不僅為一種腫瘤抑制因子，亦能影響細胞生長的大小與其週期 (Huang et al., 2014)。

腦下垂體分泌的促性腺激素刺激卵巢的類固醇生成(steroidogenesis)、濾泡成長與發育、最後成熟和排卵，發育中的濾泡為生成類固醇激素，其細胞色素P450的活性需要增加，細胞色素P450會產生像過氧化氫這一類的ROS (Ortega-Camarillo et al., 1999)，故ROS 參與濾泡生成和濾泡類固醇生成 (Sugino et al. 2004)。卵巢濾泡的發育與存活和卵巢內ROS的含量有關，而ROS量的高低則由卵巢內ROS 清除系統 (ROS scavenging system) 所調節 (Tatone et al., 2008) 。在山羊中已證明FSH顯著刺激大型(>6mm) 濾泡製造雌二醇 (estradiol, E2 )與過氧化氫酶 (catalase，可將過氧化氫催化為水與氧) 的活性，在中、小型 (分別介於3-6mm與小於3mm) 的濾泡中，FSH的此刺激作用並不顯著，這結果暗示FSH在大型濾泡中可因產生較多的過氧化氫酶而抑制大型濾泡的退化或凋亡 (Behl and Pandey, 2002)。這些酶在大多數生殖組織中是高度活性的，說明ROS確實對生殖是必需的。

在濾泡的發育過程中，缺氧狀態 (hypoxia) 是濾泡層中的顆粒細胞常常發生的 (Tropea et al., 2006)。缺氧是誘發濾泡血管新生(angiogenesis)的重要原因，濾泡的血管新生對濾泡的發育與成長非常重要，濾泡的血管新生不良會導致濾泡的萎縮退化(atresia) (Greenwald and Terranova, 1988)。組織生長需要細胞體積與數目的增加及血管系統支援，血管內皮細胞成長因子(VEGF)對於血管新生是一個相當重要的因子。PTEN調控組織或細胞大小與數量的能力，在鰻魚我們證明高的卵巢VEGF的表現和低的PTEN的表現量同時出現卵巢卵徑發育最均勻 (陳，2007)，同時卵巢的發育和卵巢PTEN的表現量呈反比 (reviewed by Gwo et al., 2014)。缺氧影響ROS的製造，而對血管新生作用，證明ROS在缺氧狀態和血管新生之間扮演訊息傳遞者的角色 (Schroedl et al., 2002; Pearlstein et al., 2002; Basini et al., 2004)，缺氧狀態受影響最大的胞器應該是粒線體，因為粒線體是進行呼吸作用的地方，而粒線體是細胞內ROS的最大製造者，故ROS在這網絡中應有重要的功能。

若卵質的下降是因為重複的以外源性促性腺激素刺激卵巢，我們不僅要問: 1)以外源性促性腺激素的刺激如何損害卵巢? 2)在正常生理狀態下，卵巢是如何應付因內源性促性腺激素所誘發的氧化損傷? 一方面除了是生物體內生理的正負回饋機制以控制激素的質(複雜的組合)與量(適當不過量)外，另一方面是細胞內具平衡激素不過量刺激的回饋機制，如PTEN (reviewed by Gwo et al., 2013)。對濾泡生成  而言，氧化代謝 (oxidative metabolism) 是一種重要卵巢內因子 (intraovarian factor)，自由基與抗氧化劑一起扮演複雜而多功能的角色 (reviewed by Diamanti-Kandarakis et al., 2017)。

在輔助生殖技術 (assisted reproductive technology, ART) 的應用中，卵巢重複的以外源性促性腺激素刺激，會使卵巢受氧化損傷 (Park et al., 2015)。ART的結果顯示: 濾泡液中某些氧化壓力 (OS) 指標的高低和生育是否成功有關，這些氧化壓力指標 (丙二醛(MAD)、一氧化氮(NO)、活性氧(ROS)、脂肪過氧化 (lipid peroxides, LPO) 等) 若越高則生育成功率則越低 (Das et al., 2006)。在人工生殖，OS可能是不明原因失敗的重要原因之一，可能和卵巢庫存量（Ovarian reserve）(卵巢庫存量是指雌性卵巢内存留卵子的質量和數量)減少有關，而卵巢庫存量的減少與卵巢對促性腺激素刺激的反應不良有相關性 (Appasamy et al., 2008)。對發育中的卵濾泡，ROS使脂質氧化被認為是造成卵質不良的原因 (reviewed by Ciani et al., 2015)，同時使卵細胞的粒線體 DNA (mtDNA) 產生突變 (reviewed by Chao et al., 2007)，導致卵質的下降 (reviewed by Xie et al., 2016)。 所謂的卵質 (oocyte quality) 是指卵細胞可被受精和產生活胚胎的能力，這和濾泡的發育有很大的相關性 (Hennet et al., 2013)。而且在恆河猴的實驗中 多次的促性腺激素處理會改變卵巢很多蛋白質的表現，這些蛋白質大都來自粒線體與細胞質，影響卵巢濾泡的分化，雖然對卵巢的微型態和功能無顯著的影響，但對於濾泡顆粒細胞所產生的負面影響可延續數年 (Dong et al., 2014)。線粒體產生ATP過程中會釋放活性ROS，ROS會損傷線粒體的DNA （mtDNA），導致mtDNA的突變和缺失，而 mtDNA突變和缺失的積累降低了粒腺體能量產生與製造的功能 (reviewed by Chappel, 2013)。在許多物種，線粒體氧化磷酸化和ATP的產生對受精卵的早期發育是很重要的(reviewed by Chappel, 2013)。過度刺激(重複促性腺激素處理)會損害卵細胞內的線粒體功能; 在猴子，以FSH (follicle stimulating hormone) 過度刺激的母猴，其卵細胞與年齡匹配的未刺激的相比，過度刺激的卵細胞顯示其mtDNA有更高程度的缺失 (Gibson et al., 2005)。在老鼠的實驗也有類似的結果 (Combelles et al., 2003; Ge et al., 2012)。或許，在鰻魚，這解釋為何人工催熟產生的卵其受精率不良而在7-14天內死亡率奇高。

細胞產生的超氧化物陰離子會自發性的或經由岐化酶 (dismutase) 分解為過氧化氫 (Prasad, 2016)。有特定的金屬酶來清除超氧化物自由基¸，其中銅-鋅超氧化物歧化酶（Cu, Zn superoxide dismutase, Cu,Zn-SOD）位於細胞質中; 錳-超氧化物歧化酶（Mn-SOD）位於線粒體中。超氧化物歧化酶 (SOD) 將超氧自由基代謝為過氧化氫，過氧化氫再經過氧化氫酶 (catalase) 或穀胱甘肽過氧化物酶 (glutathione peroxidase, GPx) 進一步代謝成水和氧。過氧化氫酶，位於細胞的過氧化物酶體內，是種鐵金屬酶可將過氧化氫催化成水和氧。穀胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)，一種含有硒 (selenium) 的酶，可降解脂質過氧化物與過氧化氫。在對抗ROS的防禦系統中，SOD是第一個酶性步驟，SOD不僅保護細胞免受ROS的傷害，而且可利用控制超氧化物自由基的量來調節細胞功能 (Sugino, 2005)。

卵巢濾泡的發育與存活和卵巢內ROS的含量有關， 而ROS量的高低則由卵巢內ROS 清除系統 (ROS scavenging system) 所調節 (Tatone et al., 2008)。在卵巢，抗氧化酶的蛋白質出現在濾泡鞘細胞和濾泡顆粒細胞(Tamate et al., 1995; Sugino et al., 1996)，這推測濾泡類固醇的合成可能與抗氧化酶活性有關係，且濾泡中的卵細胞所受的氧化壓力(OS)強度並不極端 (2)。早期卵細胞所處的卵濾泡液中富含抗氧化酶 (SOD、Catalase、GPx、glutathione transferase、glutathione reductase)，有助於保護卵細胞免受氧化損傷 (Jozwik et al., 1999; Carbon et al., 2003)。在大鼠中證明適度的氧化壓力(OS)刺激卵巢中激素鞘-間皮細胞 (theca-interstitial cells) 的增生，而較高的氧化壓力則有抑制的效果，反而抗氧化劑與抑制鞘細胞增殖有關 (Duleba et al., 2004)。抗氧化酶的不足導致產生過量的氧化壓力(OS)，造成脂質過氧化作用而影響卵巢激素(類固醇與醣蛋白激素)的生成 (reviewed by Appasamy et al., 2008)。

濾泡顆粒細胞和濾泡鞘內膜細胞可由銅，鋅-超氧化物歧化酶 (Cu,Zn-superoxide dismutase, Cu,Zn-SOD) 和錳-超氧化物歧化酶 (Mn-superoxide dismutase,Mn-SOD) 去清除超氧自由基而來保護，以利進行類固醇生成和維持濾泡發育。同時，有學者推測:  Cu,Zn-SOD 對調節濾泡鞘細胞製造類固醇的作用可能經由影響合成過氧化氫而達成。(Sugino, 2005)。Mn-SOD在濾泡發育過程重要，因為Mn-SOD保護顆粒細胞或內鞘細胞免於因類固醇生成作用旺盛而在線粒體中產生的大量超氧化物自由基的傷害 (Tilly and Tilly, 1995)。

而細胞內可以清除過氧化氫的脢，除了過氧化氫酶和穀胱甘肽過氧化物酶之外，還有過氧氧化還原酶 (peroxiredoxins, Prdx)，實驗證明過氧氧化還原酶 (Prdx) 可有效的清除因細胞激素或成長因子所刺激產生的過氧化氫 (Jin et al., 1997; Kang et al., 1998)。Prdxs不僅可消除ROS，而且可能參與細胞增生、細胞凋亡和細胞間訊息傳遞 (Seo et al., 2000)。已證明在大鼠中，在外源性促性腺激素刺激下，其卵巢中的Prdx I的表現是受影響與調節的，推測Prdx I在卵巢濾泡發育中可能具有某種生理功能 (Lee et al. 2011)。Prdx (Prdx II) 的轉錄和蛋白質表現早在初級濾泡就開始並持續到最後成熟的早期。(Wang et al., 2010) 。在離體實驗，轉染針對Prdx II基因的siRNA (small interfering RNA，小分子干擾核糖核酸) 可抑制初代濾泡細胞 (primary cultured GCs) 的增生並誘導細胞的凋亡; 此外，抑制Prdx II會導致內源性過氧化氫的增加，並且降低消除外源性過氧化氫的能力 (Yang et al., 2011)。雌性小鼠以促性腺激素 (PMSG / hCG) 混合處理後，其Prdxs (Prdx I-IV) 的蛋白質表現量在卵巢中增加的最顯著，而在其生殖系統的組織中，Prdx1的蛋白質表現量受PMSG / hCG處理的影響最大，多次超級排卵誘導(重複的PMSG / hCG注射)使氧化壓力強力升高，最終導致雌性小鼠生殖器官中的Prdxs (Prdx I-IV) 過氧化，進而損傷雌性小鼠的生殖系統，推測細胞內Prdxs在外源性促性腺激素處理時，在維持雌性小鼠的生殖器官的正常狀態有重要的作用 (Park et al., 2015) 。

鰻魚人工繁殖是藉由長期注射異種生物腦下垂體研磨萃取液而達成，此種操作手法類似於哺乳動物的”人工輔助生殖技術(assisted reproductive technology, ART)”，雖然使用腦下垂體研磨萃取液雖然能夠促進日本鰻卵濾胞的發育，但是長期催熟結果則是表現在卵胞數目減少、卵徑頻度分佈呈現不同步化 (Satoh et al., 1992; Tanaka et al., 2001; Wang and Lou, 2007)，並影響最後的孕卵數 (fecundity)。在人類醫學與畜牧業，證明注射外源性促性腺激素是導致受精或胚胎發育失敗的重要原因之一 (Walton et al., 1983)。種鰻的性腺發育能被腦下垂體研磨萃取液有效的刺激，但目前實際所遇到的問題是: 1). 鰻魚種魚無客觀而有效的挑選標準； 2). 某些被挑選到的鰻魚種魚其孕卵數不高； 3) 並非所有的處理的鰻魚種魚都能達到最後成熟與排卵； 4). 腦下垂體研磨萃取液注射種鰻刺激性腺發育，易發生卵細胞發育不同步，影響誘導最後成熟時機的認定，導致受精率與孵化率低下。

已經證明鰻魚卵巢發育可被雄性素 (androgens) 單獨刺激 (Anguilla japonica: Lin et al., 1991; Anguilla anguilla: Vidal et al., 2004)，催熟添加雄性素被證明具有更刺激鰻魚卵巢發育的效果 (歐洲鰻： Vidal et al., 2004； 日本鰻：Wang and Lou,2007; Huang et al., 2012；澳洲鰻, Rohr et al., 2001; Lokman et al., 2007)。腦下垂體研磨萃取液添加雄性素，一方面促進卵濾胞對腦下垂體研磨萃取液的感受性，使得卵濾胞進行卵黃蓄積並且同步化生長發育 (Wang and Lou, 2007)。本實驗室證明，雖然目前無野生自然成熟鰻魚作為對照比較組，發現在卵巢人工催熟過程中，卵巢發育程度和血管新生基因表現密切相關 (陳 2009; 張 2009)，但在人工催熟過程中卵巢中VEGF-Flk系統的表現量是下降的。而睪固酮的添加，對鰻魚卵巢初期發育有改善的效果，我們初步的實驗證據顯示：此改善效果似乎是經由影響卵巢血管新生相關基因而達成，而我們也證明腦下垂體萃取液添加雄性素可刺激鰻魚卵巢VEGF-Flk表現與抑制卵巢PTEN的表現 (Huang et al., 2012)。越來越多的證據顯示刺激卵巢產生的卵巢自泌性因子(VEGF、Angpt1、insulin、IGFs、AMH、GDF-9、BMPs和PTEN)對卵巢初期發育的啟動非常重要。在哺乳動物，抗氧化酶的不足導致產生過量的氧化壓力(OS)，造成脂質過氧化作用而影響雌類固醇激素的產生，並影響上述卵巢激素的生成，故這些卵巢激素已被利用作為用於預測卵巢反應的標識 (reviewed by Appasamy et al., 2008)。

以鰻魚為研究對象的優點為 1). 鰻魚的生物特性，鰻魚若不下海進行生殖洄游，則其卵巢發育則停滯於初級卵細胞，若要再進一步發育則可利用腦下垂體研磨萃取液注射加以人工誘導，方便實驗之進行與控制；2). 一般認為日本鰻魚是一次產卵型的魚種，故卵細胞之發育有同步化的特性，方便實驗結果之研判；3). 鰻魚在台灣具相當的養殖歷史與養殖相關產業規模。雖然種鰻的卵巢能被腦下垂體研磨萃取液有效的刺激發育，但所要解決的問題是 “重複注射刺激性腺發育，易發生卵細胞發育不同步，影響誘導最後成熟時機的認定，導致受精率與孵化率低下”是否和卵巢的過度刺激亦或是卵巢的抗氧化脢有關 ? 本計畫擬研究鰻魚在人工催熟過程中，調查與研究卵巢發育和各類抗氧化酶(SOD、GPx、catalase、Prdx、glutathione transferase、glutathione reductase)的相關性，並探討催熟過程中抗氧化酶和雄性激素添加和鰻魚卵巢本身的自生性成長因子與抑制因子(PTEN)的交互作用，希望能從實驗結果中找到改善鰻魚人工催熟結果的處理方法。